dc.contributor.author
Falenski, Alexander
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:34:53Z
dc.date.available
2012-08-08T09:50:29.539Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13565
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17763
dc.description.abstract
Zur Bewertung des Risikos im Fall einer absichtlichen Ausbringung von
Brucellen in die Lebensmittelkette sind Kenntnisse zur Tenazität des Erregers
in relevanten Lebensmittelmatrizes erforderlich. Daher wurde das Überleben von
Brucella abortus 1119-3 in Rohmilch sowie in kommerziell erhältlichen
Lebensmitteln wie H-Milch, Vorzugsmilch, Joghurt und stillem Mineralwasser bei
handelsüblichen Lagerungstemperaturen untersucht. Besonders lange überlebten
B. abortus 1119-3 und B. melitensis 16M in H-Milch, in der die Zellzahl
anstieg und bis zum Ende des Versuchs nach 88 Tagen eine Konzentration von
über 10^8 KbE/ml aufwies. In stillem Mineralwasser war B. abortus 1119-3 über
einen Zeitraum von 60 Tagen kulturell nachweisbar, wobei die Zellzahl
kontinuierlich abnahm. Bis zum Ende der Mindesthaltbarkeit des Produktes
(jeweils vier Tage) überlebte der genannte Stamm in Vorzugsmilch und Rohmilch.
In Joghurt konnten hingegen lebende Zellen nur zwei (1,5 % Fett), vier (3,5 %
Fett) bzw. einen Tag (10 % Fett) nachgewiesen werden, wobei der schnelle
Rückgang der Zellkonzentration wahrscheinlich durch den niedrigen pH-Wert von
4,2 verursacht wurde. Bei einer absichtlichen Kontamination würden Brucellen
für zwei Wochen (stilles Mineralwasser) bzw. über Monate (H Milch) in einer
hohen Konzentration in den Lebensmitteln überleben und beim Verzehr mit hoher
Wahrscheinlichkeit zu einer Brucellose führen. Für die Erkennung und
Typisierung von Brucellen im Fall der absichtlichen Kontamination von
Lebensmitteln müssen geeignete Schnellmethoden zur Verfügung stehen. Deshalb
wurden sechs verschiedene Methoden in Kombination mit der PCR auf ihre
Effizienz zur Extraktion und zum Nachweis von Brucella-DNA aus relevanten
Lebensmittelmatrizes untersucht. Für stilles Mineralwasser und physiologische
Kochsalzlösung erwies sich das QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) mit einer
Nachweisgrenze von 5 x 10^1 KbE/ml am sensitivsten. Für Rohmilch eigneten sich
sowohl der Kit von Qiagen als auch die Phenol-Chloroform-Extraktion, wobei
letztere mit höherer Zuverlässigkeit bis zu 5 x 10^1 KbE/ml nachwies. Die
Nachweisgrenze für Brucellen in Joghurt (10 % Fett) lag bei Anwendung der
Phenol-Chloroform-Extraktion mit 1 x 10^2 KbE/ml niedriger als mit dem QIAamp
DNA Mini Kit (1 x 10^4 KbE/ml). Mit der für Milchprodukte tauglichen Phenol-
Chloroform-Extraktion wurden bis zu 5 x 10^2 KbE/g in Camembert und in
Ziegenfrischkäse nachgewiesen. Die DNA-Extraktion aus Weichkäse erfordert eine
Homogenisation nach Verdünnung mit Flüssigkeit und führt deshalb zu einer
Abnahme der Sensitivität. Im Gegensatz zur mehrere Tage dauernden Kultivierung
von Brucellen auf Nährmedien, für die ein Labor der Sicherheitsstufe 3
erforderlich ist, kann durch die Kombination aus DNA-Extraktion und Real-Time
PCR ein Nachweis innerhalb eines halben (QIAamp DNA Mini Kit) bzw. innerhalb
eines Arbeitstages (Phenol-Chloroform-Extraktion) in einem Labor der
Sicherheitsstufe 2 erfolgen. Eine Erhöhung der Sensitivität zum Nachweis der
Brucella-DNA war allerdings mittels Real-Time PCR im Vergleich zur
herkömmlichen PCR nicht möglich. Mit dem Ziel, die Nachweisgrenzen für
Brucella-DNA insbesondere in Milchprodukten zu optimieren, wurde die
immunomagnetische Separation (IMS) als spezielle Methode für die
Voranreicherung und Aufreinigung der DNA untersucht. Zu diesem Zweck wurden
tosylaktivierte immunomagnetische Partikel eingesetzt, die mit einem
Brucellose-Vollserum bzw. einem monoklonalen anti-Brucella-Antikörper
beschichtet waren. Trotz Optimierung der IMS in Abhängigkeit verschiedener
Parameter, wie Probenvolumen, Inkubationszeit und temperatur lag die Grenze
zum Nachweis der Brucella-DNA bei 5 x 10^3 KbE/g für Ziegenfrischkäse, bei 1 x
10^3 KbE/ml für Rohmilch und stilles Mineralwasser, bei 8 x 10^4 KbE/ml für
Joghurt und bei 5 x 10^4 KbE/g für Camembert und war deshalb weniger sensitiv
als die vorgenannten Extraktionsmethoden.
de
dc.description.abstract
In case of a deliberate contamination of the food chain with brucellae it is
important to know the survival of the bacteria in relevant food matrices.
Therefore, the survival of Brucella abortus 1119-3 was investigated in raw
milk as well as in commercially available foods like UHT-milk, certified raw
milk, yogurt and still mineral water at general storage conditions. B. abortus
1119-3 and B. melitensis 16M survived longest in UHT-milk in which the total
cell count multiplied to more than 10^8 cfu/ml at the end of the product’s
shelf life after 88 days. In still mineral water viable cells of B. abortus
1119-3 could be detected for 60 days in culture. Until this day the total cell
count declined continuously. In raw milk and certified raw milk this strain
survived until the end of the product’s shelf life (four days, respectively).
In yogurt viable cells could be detected for two days (1.5 % fat), four days
(3.5 % fat) or one day (10.0 % fat), most probably due to the low pH of 4.2.
In case of a deliberate contamination brucellae would survive at a high
concentration for two weeks (still mineral water) or for months (UHT-milk) so
that ingestion of the food would most probably lead to brucellosis. Suitable
methods for the fast detection and typing of brucellae should be available in
case of deliberate contamination of foods. Therefore, six different methods
used in combination with PCR were examined regarding their efficiency to
extract and detect Brucella-DNA from relevant food matrices. For extraction
from still mineral water and physiological saline, the QIAamp DNA Mini Kit
(Qiagen) revealed the best detection limit of 5 x 10^1 cfu/ml. For raw milk
both the kit and the phenol chloroform extraction were best suited of which
the latter was more reliable at a detection limit of 5 x 10^1 cfu/ml. The
detection limit for brucellae in yogurt (10 % fat) was better with phenol
chloroform extraction (1 x 10^2 cfu/ml) than with QIAamp DNA Mini Kit (1 x
10^4 cfu/ml). By means of phenol chloroform extraction which is most suitable
for milk products, the detection limit for Brucella DNA in camembert and goat
cheese corresponded with 5 x 10^2 cfu/g. The extraction of DNA from soft
cheese requires a homogenisation after dilution in a fluid which diminishes
sensitivity. In contrast to cultivation of brucellae on nutrient agar for
several days under biosafety level 3 conditions, the detection by using DNA
extraction followed by real-time PCR can be achieved within half a working day
(QIAamp DNA Mini Kit) or alternatively within one day (phenol chloroform
extraction ) under biosafety level 2 conditions. However, the limit for
detection of Brucella DNA could not be improved by use of real-time PCR
compared to the classical PCR. In order to optimize the detection limits for
Brucella DNA especially in milk products, the immunomagnetic separation (IMS)
was tested as a pre-enrichment and purification procedure. For this purpose,
tosyl activated immunomagnetic particles coated with brucellosis serum or with
a monoclonal anti-Brucella antibody were used. Despite the optimization of IMS
considering different parameters such as sample volume, incubation time and
temperature, the limit for the detection of Brucella DNA was 5 x 10^3 cfu/g
for goat cheese, 1 x 10^3 cfu/ml for raw milk and still mineral water, 8 x
10^4 cfu/ml for yogurt and 5 x 10^4 cfu/g for camembert and was thus less
sensitive than DNA extraction methods mentioned above.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
immunomagnetische Separation
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::579 Mikroorganismen, Pilze, Algen
dc.title
Tenazität von hochpathogenen Erregern in Lebensmitteln und Schnellmethoden zu
deren Nachweis am Beispiel Brucella
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Bernd Appel
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Rupert Mutzel
dc.date.accepted
2012-07-19
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000038706-6
dc.title.translated
Tenacity of highly pathogenic agents in foods and rapid detection methods for
Brucella
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000038706
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011801
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access