Identifizierung und Charakterisierung von zellulären Zielstrukturen der regulatorischen (Rep) Proteine des Adeno-assoziierten Virus (AAV)

Abstract

Die molekularen Mechanismen der vielfältigen Effekte der Rep Proteine des Adeno-assoziierten Virus (AAV) auf den Zellzyklus, die virale und zelluläre DNA Replikation, die Zelltransformation durch virale und zelluläre Onkogene und die Expression homologer und heterologer Promotoren sind bisher nur ansatzweise untersucht worden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten daher zelluläre Zielstrukturen der AAV Rep Proteine identifiziert und charakterisiert werden. Eine Mutationsanalyse der für die Beeinflussung verschiedener homologer und heterologer Promotoren erforderlichen Domänen der Rep Proteine sowie die Mutationsanalyse der jeweiligen Promotoren sollte dabei erste Aufschlüsse über die mögliche Identität solcher Zielstrukturen liefern. Von besonderem Interesse war die Fragestellung, in welchem Ausmaß die Rep- vermittelte Regulation der Transkription abhängig ist von der Wechselwirkung der Rep Proteine mit cis-aktiven Nukleinsäuresequenzen oder aber von der Wechselwirkung mit zellulären Proteinen. Ausgehend von diesen Befunden sollten dann zelluläre Protein-Interaktionpartner der Rep identifiziert, eingehend charakterisiert und die Bedeutung dieser Interaktionen für die verschiedenen biologischen Funktionen der Rep Proteine untersucht werden. Ein Hauptaugenmerk galt dabei der Identifizierung von zellulären Proteinen mit möglichen onkogenen oder tumorsuppressiven Eigenschaften und ihrer funktionellen Charakterisierung.

The regulatory (Rep) proteins of the adeno-associated virus (AAV) exhibit are pleiotropic regulators of cell cycle progression, viral and cellular DNA replication, cell transformation by viral and cellular oncogenes, and expression from homologous and heterologous promoters. The molecular mechanisms of these pleiotropic effects are only poorly understood so far. The aim of the present study was to identify cellular target structures of the large Rep proteins Rep78 and Rep68 both at the level of regulatory nucleic acid sequences and protein factors. Rep-mediated inhibition of gene expression seems was found to be mostly dependent on interaction with general components of the transcription machinery. A search for cellular proteins interacting with the Rep proteins resulted in the identification of several factors possibly involved in the biological effects of the large Rep proteins. These factors, which included the transcriptional coactivator PC4, the SUMO-1 conjugating enzyme UBC9, the p53 and DNA topisomerase interacting protein TOPORS and KCTD5, a putative adapter protein of cullin E3 ligases, were thoroughly characterized with regard to their functions in the AAV life cycle and cellular transformation.