Untersuchungen zur Geninaktivierung innerhalb einer Generationsanalyse transgener homozygoter Vicia narbonensis-Linien: Anwendungsmöglichkeiten eines entwicklungspolitischen Konzepts am Fallbeispiel Ruanda

Abstract

Nach stabiler Integration von Transgenen kommt es häufig zu Veränderungen in der Expression der Transgene bis hin zur vollständigen Geninaktivierung. In den meisten Forschungsarbeiten über Inaktivierung von Genen in höheren Pflanzen wurde in diesem Zusammenhang in der Regel das Vorhandensein von homologen DNA-Sequenzen beobachtet. Diese Homologien und das damit einhergehende "gene silencing" betraf entweder die ins pflanzliche Genom eingebrachten Fremdgene selbst, wenn mehrere Kopien ins Genom integriert wurden, oder endogene Gene, wenn zusätzlich homologe Sequenzen ins Genom integriert wurden. Nur in wenigen Fällen wurde der Verlust oder die Reduktion der Genexpression nach der Integration einer Kopie der Fremd-DNA beschrieben. Basierend auf diesen Forschungsstand wurden für die Generationsanalyse Pflanzen ausgewählt, die jeweils nur eine Kopie der T-DNA integriert hatten. Für die Untersuchungen zur Stabilität und Expression von zwei Transgenen in mehreren aufeinanderfolgenden Selbstungsgenerationen wurden Samen von zwei unabhängigen transgenen Vicia narbonensis-Linien verwendet. Die transgenen Linien wurden durch Agrobakterien vermittelte Transformation mit dem Agrobakterium tumefaciens-Stamm C58CI, der das kointegrative Plasmid pGV3850Hygro enthielt, hergestellt. Das Plasmid trägt ein in höheren Pflanzen aktives Hygromycinphosphotransferasegen (HPT-Gen) mit dem CaMV 35S-Promotor und ein Nopalinsynthasegen (NOS-Gen) mit vorgeschaltetem NOS-Promotor. Im Laufe der ersten Untersuchungen zur Kosegregation der Expression der beiden Transgene zeigte sich, daß einige Nachkommen beider Linien einen Verlust der Expression des HPT-Gens aufwiesen, während das NOS-Gen über alle untersuchten Generationen in beiden Linien stabil exprimiert wurde. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit galt die besondere Aufmerksamkeit dem Phänomen des "gene silencing" und den in diesem Zusammenhang beobachteten DNA-Methylierungen. Mit Hilfe der Bisulfit-Modifikation der DNA wurden vergleichende Analysen zum Methylierungsstatus der vorgeschalteten Promotoren und einer 200bp-Sequenz der 5'-Enden beider Strukturgene durchgeführt. Insbesondere wurde der Einfluß von starken Temperaturdifferenzen während der Entwicklung der Pflanzen auf die Expression der beiden Fremdgene untersucht. Im Zusammenhang mit dem "gene silencing" des HPT-Gens von Pflanzen, welche unter klimatisierten Gewächshausbedingungen kultiviert wurden, konnten Hypermethylierungen innerhalb des 35S-Promotors beobachtet werden. Erstaunlicherweise fand sich jedoch keine Korrelation zwischen der Inaktivierung des HPT-Gens und Hypermethylierungen innerhalb der 35S-Promotorsequenz bei Pflanzen, welche im nicht klimatisierten Gewächshaus starken Temperaturschwankungen und hohen Temperaturen ausgesetzt waren. Unabhängig davon, ob das HPT-Gen stabil exprimiert oder inaktiviert wurde, zeigten alle Pflanzen beider Linien Hypermethylierungen innerhalb der 35S-Promotorregion und der analysierten Sequenz des HPT-Gens. Diese Ergebnisse weisen daraufhin, daß DNA- Methylierungen nicht allein die Ursache von Geninaktivierungen sind, sondern daß andere Faktoren maßgeblich beteiligt sein müssen.

Insertion of foreign DNA into plant genomes frequently results in the identification of transgenic plants with silenced transgenes. This stable but potentially reversible loss of gene activity resembles epigenetic changes. In most studies of genetically transformed plants, transgene inactivation has been correlated with multiple (complete or incomplete) copies of the transgene. The expression of single-copy transgene loci may also be negativly influenced, e.g. by chromosomal location. In order to study the presence and the inheritance of genes introduced into the grain legume Vicia narbonensis, the progeny of two independent homozygous transgenic lines that were obtained by transformation with Agrobacterium-strain C58CI carrying the plasmid pGV3850Hygro was analysed. This cointegrate vector contains the coding sequence for the hygromycin-phosphotransferase gene (HPT-gene) driven by the CaMV 35S promoter, and the nopaline-synthase gene (NOS-gene) driven by the nos-promoter. Initial transformants harbouring a single copy integration of the T-DNA and the progeny of two such clones was analysed in detail. The transgenes were inherited in the first generation according to Mendelian laws. During self-pollination prozesses, homozygous sublines were obtained and further characterised. In order to follow the transmission of the two foreign genes for a long period, biochemical and molecular analyses were performed up to the seventh generation. To examine the influence of environmental effects, plants were grown up in glasshouses with and without air-condition (high temperatur stress). Methylation-analyses at the 35S promoter and the HPT-gene of plants with silenced HPT-gene which were raised in air-conditioned glasshouses showed hypermethylation within the 35S promoter sequenz. Surprisingly, no correlation was found between hypermethylation within the promoter region and gene silencing in plants grown up under high temperatur stress in non-airconditioned glasshouses. All these plants regardless whether the HPT-gene was inactivated or not showed hypermethylation at the 35S promoter and the analysed HPT sequence. This results indicates that DNA methylation alone is not required for gene inactivation.