Einfluss bakterieller Erreger auf das Epigenom und die Seneszenz von Wirtszellen

Abstract

Das weltweit verbreitete humanpathogene Bakterium Helicobacter pylori (H. pylori, Hpy) besiedelt den menschlichen Magen und verursacht dort Ulkuserkrankungen, Tumore (u.a. das gastrische Adenokarzinom) und vereinzelt auch Lymphome des Mukosa-assoziierten lymphoiden Gewebes (MALT, mucosa- associated lymphoid tissue). Auch wenn H. pylori von der WHO als Karzinogen anerkannt ist, bleibt der Mechanismus der Karzinogenese bislang weitgehend unverstanden. Daher ist eine genauere Untersuchung der zellulären Komponenten des Wirts, die von der Infektion betroffen sind, von großer Bedeutung. Mit dieser Arbeit wird ein Wissenschaftsfeld erweitert, das sich mit Pathogen- induzierten epigenetischen Modifikationen auf Histon- und DNA-Ebene befasst und deren möglichen Einfluss auf Pathogenese und Karzinogenese nachgeht. Dabei tragen Veränderungen zellulärer Prozesse wie Apoptose und Seneszenz zu krankhaften Transformationen der Wirtszelle bei. Posttranslationale Modifikationen von Histonen stellen eine wichtige Komponente der epigenetischen Regulation dar. Dabei können bakterielle oder Toxin-induzierte Veränderungen der Histon-Phosphorylierung und -Acetylierung drastische Auswirkungen auf verschiedenste zelluläre Stoffwechselwege haben. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die H. pylori-Infektion gastrischer Epithelzelllinien zu Veränderungen des Phosphorylierungsstatus von Histon H3 führt. Dabei findet insbesondere eine transiente, Typ-IV- Sekretionssystem(T4SS)-abhängige Dephosphorylierung von Serin 10 und Threonin 3 und eine Deacetylierung von Lysin 9 statt. Des Weiteren zeigen Immunfluoreszenz-Experimente einen H. pylori-induzierten Zellzyklusarrest vor Eintritt in die Mitose, der eine Ursache für die beobachtete Histondephosphorylierung darstellt. Die Expression der Histondeacetylase HDAC9 und der epithelialen Zellverbindungskomponente Claudin-1 wird ebenfalls durch die H. pylori-Infektion aktiviert. Damit erhärtet diese Arbeit die Hypothese, dass H. pylori das Wirtszellchromatin modifiziert und somit zentrale zelluläre Prozesse, wie beispielsweise den Zellzyklusverlauf beeinflusst. Die epigenetische Veränderung der DNA aufgrund von Methylierungssignaturen stellt einen weiteren wirksamen Mechanismus der Genregulation dar. Globale Analysen, basierend auf Methylierungsmicroarrays, zeigen enorme genomweite Unterschiede im Methylierungsmuster H. pylori-infizierter Zellen im Gegensatz zu den Kontrollen. So ist die Mehrheit der untersuchten Cytosin-phosphatidyl- Guanin(CpG)-Inseln post infectionem (p.i.) hypermethyliert. Hypomethylierung tritt hingegen stark gehäuft in Promotorregionen auf, was eine veränderte Transkription zellulärer Gene zur Folge hat. Bemerkenswerterweise sind vor allem Gene von Krebssignalwegen, Komponenten des DNA- und Chromatinaufbaus sowie der RNA-Polymerase differenziell methyliert. Darüber hinaus existieren epidemiologische Daten, die eine Verbindung zwischen der Infektion mit Chlamydia trachomatis (C. trachomatis, Ctr) und gynäkologischen Krebserkrankungen zulassen, jedoch sind auch hier bisher keine zellulären Mechanismen nachgewiesen. Basierend auf einer mittels Doxycyclin-behandelten C. trachomatis-infizierten Zellkultur wird in dieser Arbeit ein Modell beschrieben, das die Untersuchung der Auswirkungen dieser Infektion auf nachfolgende Zellpopulationen zulässt. Dabei zeigt sich, dass die mRNA- Expression der katalytischen Untereinheit der humanen Telomerase (human telomerase reverse transkriptase, hTERT) zum akuten Zeitpunkt der Infektion ansteigt und langfristige Veränderungen für die Wirtszelle nach sich zieht. Die dabei erhöhte hTERT-Expression wird positiv durch zelluläres Ceramid reguliert, sodass eine gesteigerte hTERT-Regulation durch Inhibition des zellulären Ceramid-Transports aufgehoben wird. In ehemals infizierten Zellen kann nachgewiesen werden, dass Telomere verlängert vorliegen und DNA- Schädigungen reduziert sind. Auch die DNA-Bindung von p53 an den Zellzyklus- Regulator p21 und dessen Proteinlevel ist in ehemals infizierten Zellen verringert. In Folge dessen entwickelt diese Zellpopulation eine verstärkte Resistenz gegenüber Etoposid-induzierten Schädigungen der DNA und Apoptose. C. trachomatis beeinflusst somit Apoptose und Alterung der Wirtszelle sowie entscheidende Signalwege für das Überleben der Wirtszelle.

The widespread human pathogenic bacterium Helicobacter pylori (H. pylori, Hpy) colonizes the human stomach and causes ulcer disease, tumors (including gastric adenocarcinoma), and sporadically gastric mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) lymphoma. Although H. pylori is recognized as a carcinogen by the WHO, so far the mechanism of carcinogenesis remains poorly understood. Therefore, a closer examination of the host cellular components affected by H. pylori infection, is of great importance. The presented work opens a new field in current science that deals with pathogen-induced epigenetic modifications on both histone and DNA level and investigates their potential impact on pathogenesis and carcinogenesis. Here, changes in cellular processes such as apoptosis and senescence can lead to pathological transformations of the host cell. Posttranslational modifications of histones are an important component of epigenetic regulation. Bacterial- or toxin-induced changes in histone phosphorylation and acetylation can have drastic effects on various cellular metabolic pathways. This work reveals that H. pylori infection of gastric epithelial cells leads to changes in the phosphorylation of histone H3. In particular, a transient type IV secretion system (T4SS)-dependent dephosphorylation of serine 10 and threonine 3 as well as deacetylation of lysine 9 of histone H3 was detected. Furthermore, immunofluorescence experiments show an H. pylori-induced cell cycle arrest prior to entry into mitosis, which is a cause of the observed histone-dephosphorylation. The expression of histone deacetylase HDAC9 and the epithelial tight junction component claudin-1 was also found to be activated by H. pylori infections. This work profoundly confirms the hypothesis that the chromatin-architecture of the host cell is modified by H. pylori and thereby influences essential cellular processes such as the cell cycle progression. Epigenetic modification of DNA due to rearrangement of methylation signatures represents an effective mechanism of gene regulation. Global analyzes based on methylation microarrays show broad differences in genome-wide methylation patterns of H. pylori- infected cells compared with controls. Thus, the majority of the investigated cytosine-phosphatidyl-guanine (CpG) islands is hypermethylated post infectionem (p.i.). In contrast, hypomethylation occurs mainly in promoter regions which results in altered transcription of cellular genes. Notably, particularly genes related to cancer pathways, components of the DNA and chromatin assembly as well as the RNA polymerase are differentially methylated. Further, there are epidemiological data that allow an association between infections with Chlamydia trachomatis (C. trachomatis, Ctr) and several types of gynecological cancers – however, cellular mechanisms have not been described so far. A cell culture model based on doxycycline treatment of C. trachomatis infections could be established, which allows investigating the impact and outcome of this infection on subsequent cell populations. Here, it was demonstrated that mRNA expression of the catalytic subunit of the human telomerase reverse transcriptase (hTERT) increases during acute infections and leads to long-term alterations of the host cell. Increased hTERT mRNA expression is positively regulated by cellular ceramide. hTERT upregulation is abolished by inhibition of intracellular ceramide. Further, it could be demonstrated that in previously infected cells telomeres are present in an extended state and DNA damage signaling is reduced. Decreased DNA binding of p53 to the promoter region of the cell cycle regulator p21 and reduced p21 protein levels are found in cells cleared of the infection. This cell population develops an interesting phenotype: It exhibits an increased resistance towards etoposide-induced DNA damage and apoptosis. Thus, C. trachomatis is rigorously influencing host cellular aging, apoptosis and survival signaling pathways.