Die Rolle der MAP-Kinasen bei der Pneumokokken-induzierten neuronalen Apoptose

Abstract

Die Pneumokokken-Meningitis ist trotz weiterentwickelter antiinfektiver Therapien, dem nachgewiesenen klinischen Benefit einer additiven Kortikosteroidtherapie und aller intensivmedizinischer Maßnahmen nach wie vor mit einer sehr hohen Mortalität und Morbidität verbunden. Dieses schlechte Outcome ist zum einen durch wirtseigene Immunabwehrmechanismen, zum anderen durch bakterieninduzierte Vorgänge zu erklären. Deshalb ist es von entscheidender Bedeutung für eine Verbesserung der Prognose dieser Erkrankung, die spezifischen Schadensmechanismen zu identifizieren, um so die Grundlage für die Entwicklung neuer, spezifischer Medikamente zu schaffen. Ein entscheidender Punkt vor allem auch in Hinblick auf die hohe Morbidität mit häufig auftretendem Hörverlust, epileptischen Anfällen oder kognitiven Behinderungen - um nur einige Beispiele zu nennen - ist die durch Pneumokokken ausgelöste Apoptose von Neuronen, auf deren Mechanismen in der vorliegenden Arbeit eingegangen wurde. Es ist aus Vorarbeiten bekannt, dass hierbei nicht der „klassische“ Apoptosemechanismus über eine Caspasen-Aktivierung stattfindet. Um eine Minderung der neuronalen Apoptose zu erzielen, ist es daher erforderlich, die stattfindenden alternativen Apoptosemechanismen zu identifizieren. MAP-Kinasen (Mitogen-activated protein kinases) haben in Form von Kinasekaskaden pleiotrope Effekte in Hinblick auf Zelldifferenzierung, Zellteilung, Zellimmunantworten und auch den Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass MAP-Kinasen Einfluss auf die Pneumokokken- induzierte neuronale Apoptose ausüben. So konnte mit Hilfe des Western Blots - konzentrations- und zeitabhängig - eine Aktivierung der MAP-Kinasen p44/42 und p38 sowie eine Inaktivierung der MAP-Kinase JNK während der Apoptose von primären Rattenneuronen nachgewiesen werden. Offenbar sind die beiden Virulenzfaktoren Pneumolysin und H2O2 wesentlich an der Aktivierung bzw. Inaktivierung dieser MAP-Kinasen beteiligt, denn die Pneumolysin- und H2O2-defiziente Pneumokokken-Doppelmutante konnte diese Vorgänge nicht oder nur in abgeschwächter Form auslösen. Eine pharmakologische Inhibition der p44/42- und p38-Kinasekaskaden führte einzeln und insbesondere auch in Kombination zu einer Neuroprotektion, was fluoreszenzmikroskopisch und im ELISA quantifiziert werden konnte. Unter dieser MAPK-Inhibition konnte eine statistisch signifikante Reduktion der apoptoseinduzierenden Effektoren ROS und Kalzium in den Neuronen erzielt werden. Gleichzeitig konnte eine Protektion des mitochondrialen Intermembranpotentials erreicht werden. Hinsichtlich den MAP-Kinasen nachgeschalteter, apoptoseregulierender Proteine konnte im Western Blot keine Änderung der Quantität sowohl des proapoptotischen Proteins Bax als auch des antiapoptotischen Proteins Bcl-2 im Zytosol nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit sprechen für eine ursächliche Beteiligung der MAP-Kinasen bei der Pneumokokken-induzierten neuronalen Apoptose, die zumindest teilweise über die Bildung intraneuronaler reaktiver Sauerstoffradikale und Kalzium sowie die Schädigung des mitochondrialen Membranpotentials vermittelt wird. Die Inhibition der MAPK- Kaskaden stellt damit einen möglichen therapeutischen Ansatzpunkt in der Behandlung der Pneumokokken-Meningitis dar, der zur Reduktion der hohen Mortalität und Morbidität dieser Erkrankung beitragen könnte.

Despite modern antibiotics, additive therapy with corticosteroids and intensive care medicine, pneumococcal meningitis is still associated with poor neurological outcome and high mortality rates. Neuronal apoptosis figures largely in pathogenesis of pneumococcal meningitis and is held responsible for neurological sequelae. However, classical pathways of programmed cell death depending on activation of caspases are not activated during pneumococcal- induced neuronal apoptosis. The role of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) during pneumococcal-induced neuronal apoptosis was determined in this dissertation. Primary neurons from rat embryo cortex were prepared and used for in vitro experiments. Expression and activation of MAPKs p38, p44/42 and JNK were assessed by Western blot analysis in neurons co-incubated with and without pneumococci D39 or plnA-/spxB-, a pneumococcal strain deficient in production of both, pneumolysin and hydrogen peroxide. Rates of apoptosis were evaluated by AO/EB-staining assay and ELISA with and without concomitant inhibition of MAPKs using the specific MAPK-inhibitors PD98059, UO126, SB203580 and AG126. Cell death features such as the production of reactive oxygen species (ROS), intracellular calcium release and the mitochondrial membrane potential were assessed by fluorescence spectrometry. Incubation of neurons with pneumococci D39, but not with the plnA-/spxB- -strain, led to significant activation of p44/42 and p38, but inactivation of JNK, in a time- and dose dependent manner. Neuronal apoptotic cell death, production of ROS and intracellular calcium was significantly enhanced, mitochondrial membrane potential significantly decreased in pneumococci-treated cells. Pharmacological inhibition of p44/42- and/or p38 MAPK-pathways significantly decreased apoptosis, ROS, intracellular calcium and protected the mitochondria from breakdown of their membrane potential. This dissertation provides evidence that MAPKs are directly involved in pneumococcal-induced neuronal apoptosis. Pharmacological inhibition of MAPK-cascades exerted beneficial, neuroprotective effects. However, gaining inside into alternative mechanisms of apoptosis-induction such as involvement of MAPKs might be essential to allow for specific therapeutic intervention in the future.