Charakterisierung der EpCAM-reaktiven Immunität in Karzinompatienten

Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der humoralen Immunität in Karzinompatienten mittels Messung und Charakterisierung von Antikörpern gegen das epitheliale Zellädhäsionsmolekül (EpCAM) sowie mit der Messung von löslichem EpCAM in Patientenseren. Methoden zur Messung der Konzentration von Anti-EpCAM-Antikörpern, zu deren Subtypisierung und zur Messung von löslichem EpCAM wurde etabliert. Dabei wurden Methoden optimiert, die lösliches Protein in hoher Qualität und nativer Faltung reinigen, welche auch für die NMR- Strukturbestimmung geeignet sind. Hohe lösliche EpCAM-Werte wurden als möglicher Grund für die hohe Toleranz in Patienten mit fehlender oder stark reduzierter Antikörperantwort identifiziert. Um die Messung der zellulären Immunantwort zu verbessern, wurden neue Algorithmen zur Epitopvorhersage entwickelt. Zu Beginn der Studien wurde rekombinantes EpCAM in Insektenzellen hergestellt, um vollständig glykosyliertes und nativ gefaltetes Antigen zu erhalten. Die Expressionsvektoren wurden im Gegensatz zu anderen Studien so gewählt, dass eine Sekretion des Proteins stattfindet, sodass im Golgi-Apparat fehlerhaft gefaltetes Protein und unvollständige Proteinfragmente entfernt werden. Weitere Reinigungsschritte des Proteins (v.a. Ionenaustauscher- und hydrophobe Interaktionschromatografie) wurden eingesetzt, um Reste nicht- nativen Proteins zu entfernen. Sekundärstruktur (mittels zirkularer Dichroismusspektroskopie) und Tertiärstruktur (mittels NMR-Spektroskopie) des Proteins wurden mit kommerziell erhältlichem und in anderen Studien benutztem EpCAM-Protein verglichen. Dabei zeigte sich, dass durch das Expressionssystem (E. coli, Seidenspinnerraupen) und die Reinigung des kommerziell verfügbaren Proteins, das auch in anderen Gruppen zu hohen positiven Werten geführt hatte, nicht-glykosyliertes, fehlerhaft gefaltetes Protein angereichert wurde. Dies wurde auch bei einer NMR-Studie mit dem Chagasin-Molekül validiert. Weder die hohen Prozentzahlen positiver Patienten in den ELISAs (in der Literatur um die 50%) noch andere Ergebnisse der in der Literatur oft verwendeten durchflusszytometrischen Shift-Assays (in der Literatur um die 80% Anti-EpCAM positive Seren) konnten reproduziert werden, die Spezifität dieses Assays ist aber gering. Auch in direkten Experimenten (Immunpräzipitation, Western Blots) konnten nur in einem sehr geringen Patientenanteil tatsächlich Anti-EpCAM- Antikörper nachgewiesen werden. Im direkten Vergleich wurde eine deutlich reduzierte Zahl positiver Proben gefunden (44 von 500 getesteten Seren). Mit dem von anderen Gruppen benutzten, denaturierten Protein wurden 12-mal mehr positive Seren mit teilweise 1000-fach höheren Anti-EpCAM-Mengen gemessen. Als Vergleich nutzten wir eine Antikörpermessung gegen Tetanustoxoid, die im Mittel eine 1000-fach höhere Konzentration aufwies. Auch konnten wir nachweisen, dass eine hohe Reaktivität gegen bovines Serumalbumin vorliegt, was in früheren Studien einen Teil der hohen Werte erklären lässt. In der Literatur war mehrfach beschrieben worden, dass beinahe alle Epithelzellen EpCAM exprimieren und hohe Serumkonzentrationen von Protein häufig mit der humoralen Toleranz korrelieren. Um die Ursache für die geringe Immunreaktion zu finden, wurde daher das von der Zelloberfläche abgeschnittene Protein gemessen. Mit zwei in Kooperation (Dr. Gerd Moldenhauer, DKFZ Heidelberg) hergestellten, neuen monoklonalen Antikörpern wurde dann ein ELISA-System etabliert. Hierzu wurden auch polyklonale Seren und andere gut charakterisierte monoklonale Antikörper gegen EpCAM getestet. Ein fluorogener ELISA wurde etabliert und optimiert, der über mehrere log-Stufen eine Messung der Antikörper ermöglicht und eine 1 bis 2 log-Stufen höhere Sensitivität als chromogene ELISAs besitzt. Wir fanden hohe Konzentrationen von EpCAM, die negativ mit der Antikörperantwort korrelierten, wie es auch schon für andere Proteine beschrieben wurde.

The human epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is expressed on normal epithelial cells but overexpressed in most carcinomas. EpCAM-targeted immunotherapy has been reported in clinical studies and is currently approved by using EpCAM-CD3-bispecific antibodies. Due to the high side effects and so far limited clinical efficiency the aim of this study was to analyze the preexisting humoral response including anti-idiotypic antibodies and soluble EpCAM concentrations with a special emphasis on the purity and folding of the used protein. Anti-EpCAM positive sera were found in a much lower percentage as previously published which was due to reactivity against denatured protein. The importance of correctly folded protein could be proven by NMR- and CD- analysis in the EpCAM-ELISA, but also by structure determination with other proteins (Chagasin). In direct comparison, Tetanus toxoid reactive antibodies of the IgG isotype were present in 1000 fold higher concentration as compared to EpCAM-reactive antibodies. In contrast IgA isotype antibodies showed a higher concentration against EpCAM. We developed an ELISA-method to quantify the circulating soluble EpCAM protein in sera. High concentrations could be identified in 471 human sera with a mean concentration of 2 µg/ml. EpCAM reactive IgG antibodies were tested in the same sera but could only be detected in sera with less than 1 µg/ml circulating EpCAM. Therapeutic antibodies against EpCAM have been developed and used in clinical trials since more than 30 years. To lower side effects, the presence of high levels of circulating EpCAM and of anti-idiotype antibodies must be kept in mind.