Regulation of Melanopsin and PACAP mRNA by Light, Circadian and Sleep Homeostatic Processes

Abstract

The photopigment melanopsin plays an important role in all three processes known to regulate sleep: the circadian and homeostatic processes and the direct effects of light - results mainly relying on electrophysiological analysis. We therefore examined mRNA expression levels of melanopsin (Opn4) and retinal pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP), a neurotransmitter of the retinohypothalamic tract, which is thought to relay the melanopsin mediated signals to the brain. MRNA expression levels were determined in dependence of light, darkness and circadian and homeostatic processes in nocturnal and diurnal rodents using RT-qPCR. My results show that melanopsin mRNA concentrations follow a circadian rhythm in nocturnal (C57BL/6 mouse and albino Wistar rat) and diurnal species (Arvicanthis ansorgei). In mice, the PACAP mRNA expression was similarly affected and a comparable tendency was observed in Arvicanthis ansorgei. The phase relationship between both circadian rhythms - Opn4 and PACAP - suggests that PACAP is involved in conveying melanopsin-based photic input to the brain. In all species studied, the respective peaks of Opn4 and PACAP occurred in the activity phases of each animal. In the mouse, the highest melanopsin mRNA expression level was at the end of its activity phase (ZT21) whereas in Arvicanthis ansorgei the peak level occurred at the beginning of the same (ZT0-3). Arvicanthis ansorgei´s melanopsin expression levels were inverted when compared to the albino Wistar rat. Here, the peak was detected at the light-dark transition which is likewise considered as the beginning of its activity. In addition, I could show that melanopsin mRNA levels increased under sleep deprivation in mice and Arvicanthis ansorgei, returning to control values during recovery sleep. Again, the same pattern could be demonstrated for retinal PACAP mRNA concentration in Arvicanthis ansorgei. Thus, melanopsin could be established as a sleep homeostatic factor, providing a new concept in the field of sleep research. Finally, I could show that continuous exposure to light or darkness for three days does not influence melanopsin expression in mice or Arvicanthis ansorgei. The findings suggest that Opn4 expression is not regulated by light and dark in these animal models. These results are in contrast to results obtained in albino rats. However, the absence or presence of pigments might have an unrecognized impact. The current work improves our understanding of the mechanisms regulating melanopsin expression and provides significant clues to further understand the effect of light on sleep, alertness and associated behaviors.

Das Photopigment Melanopsin spielt eine wichtige Rolle in den drei bekannten Prozessen, die an der Regulation von Schlaf beteiligt sind: Den circadianen- und homöostatischen Prozessen und den direkten Effekten von Licht. Da diese Erkenntnisse vor allem auf elektrophysiologischen Daten basieren, haben wir die mRNA Expression von Melanopsin (Opn4) und retinalem pituitary adenylate cyclase activating polypeptide (PACAP) untersucht, um diese Ergebnisse weiter zu erhärten. PACAP wurde untersucht, da es sich um einen Neurotransmitter des retinohypothalamischen Traktes handelt, der die von Melanopsin aufgenommenen Lichtsignale an das Hirn weiterleitet. Die mRNA Expression wurde in Abhängigkeit von Licht, Dunkelheit und circadianen und homöostatischen Prozessen in nachtaktiven und tagaktiven Nagern durch RT-qPCR bestimmt. Meine Ergebnisse zeigen, dass die Melanopsin mRNA sowohl in nachtaktiven (C57BL/6 Maus und Albino Wistar Ratte), als auch in tagaktiven (Arvicanthis ansorgei) Tiermodellen einem circadianen Rhythmus folgt. In der Maus wies die PACAP mRNA ein der Melanopsin Expression ähnliches Muster auf und in Arvicanthis ansorgei war eine vergleichbare Tendenz zu beobachten. Das Verhältnis zwischen den circadianen Phasen von Opn4 und PACAP weist darauf hin, dass PACAP an der Melanopsin abhängigen Lichtübertragung zum Gehirn teilnimmt. In allen untersuchten Arten wurde das höchste Expressionsniveau während der Aktivitätsperiode des jeweiligen Tiermodells beobachtet. In der Maus war das Maximum der Expression am Ende ihrer Aktivitätsperiode (ZT21), wohingegen das Maximum in Arvicanthis ansorgei am Anfang der Aktivitätsperiode lag (ZT0-3). Das Melanopsin Expressionsniveau war im Vergleich zu den nachtaktiven Albino Wistar Ratten spiegelverkehrt. Hier zeigte sich ein Expressionshöhepunkt am Übergang von Licht zu Dunkelheit, der ebenfalls mit dem Beginn der Aktivitätsperiode korreliert. Schlafentzug induziert sowohl in Arvicanthis ansorgei, als auch in der Maus die Expression der Melanopsin mRNA und der anschließende Erholungsschlaf bewirkt das Abfallen auf ein normales Expressionsniveau. Die PACAP mRNA in Arvicanthis ansorgei zeigte ein ähnliches Muster. Die Ergebnisse deuten auf Melanopsin als Schlaf-homöostatischen Faktor hin - Hinweis auf ein neues Konzept in der Schlafforschung. Schließlich konnte ich zeigen, dass eine kontinuierliche Licht- oder Dunkelexposition die Melanopsin mRNA Expression weder in der Maus noch in Arvicanthis ansorgei beeinflusst. Opn4 wird folglich in den untersuchten Tiermodellen nicht durch Licht oder Dunkelheit reguliert. Die Ergebnisse stehen im Gegensatz zu Ergebnissen in der Albino Ratte, eine Diskrepanz die darin begründet sein könnte, dass eine fehlende Pigmentierung einen erheblichen Einfluss hat. Die vorliegende Arbeit erweitert unser Verständnis der Regulationsmechanismen von Melanopsin und gibt wichtige Hinweise zum Verständnis der Effekte von Licht auf Schlaf und dem damit verbundenen Verhalten.