Analyse des Einflusses des Amyloid-β 42 Peptids bei der Genregulation

Abstract

Es ist bekannt, dass Aβ42 Peptide stark neurotoxisch wirken, jedoch konnte bis heute der genaue Mechanismus der Toxizität nicht geklärt werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, potentielle Mechanismen in der Zelle zu beleuchten, die Aufschluss über die neurotoxische Wirkungsweise von Aβ42 wt geben. In dieser Arbeit konnte mittels ELISA, Immunfluoreszenz und Elektronenmikroskopie gezeigt werden, dass Aβ Peptide von Zellen aufgenommen werden und in den Zellkern translozieren. Die Aufnahme der Peptide in den Zellkern steht in einem engen Zusammenhang mit der Hydrophobizität der Peptide. Es wurde gezeigt, dass kürzere, weniger hydrophobe Peptide besser in den Zellkern gelangen als die längeren, hydrophoberen Aβ Peptide. Im Zellkern bindet das neurotoxische Aβ42 Peptid spezifisch an die Promotoren von LRP1 und KAI1 und rekrutiert das Adapterprotein Fe65 und die Histonacetyltransferase Tip60. Als Kontrollpromotor wurde HES1 verwendet, mit dem keine Bindung von Aβ42 wt nachgewiesen werden konnte. Die Bindungsereignisse an die Promotoren stehen in direktem Zusammenhang mit den mRNA Mengen. Es wurde gezeigt, dass das neurotoxische Aβ42 wt Peptid die mRNA Mengen von LRP1 und KAI1 supprimiert. Auf die mRNA Mengen von HES1 hatte Aβ42 wt keinen Einfluss. Interessanterweise wurde festgestellt, dass Aβ42 wt die mRNA Mengen seines Vorläufers, APP, erhöht. Im Gegensatz dazu hatten kürzere und längere, nicht- neurotoxische Aβ Peptide (Aβ38, 40, 42 G33A und 43) keinen Einfluss auf die mRNA Mengen der untersuchten Gene. Mit einem Illumina Micorarray wurden Gene identifiziert, die von dem neurotoxischen Aβ42 wt Peptid beeinflusst werden. Sechs der dabei identifizierten Gene (ID1-3, IGFBP3/ 5, LMO4) wurden Mittels qRT-PCR analysiert. Es konnte bestätigt werden, dass die mRNA Mengen der untersuchten Kandidaten von dem neurotoxischen Aβ42 wt erhöht wurden. Die Lokalisation von Aβ42 Peptiden im Zellkern konnte in vivo mittels TEM in Maushirnschnitten bestätigt werden. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass neurotoxische Aβ42 Peptide in Neuronen- und Gliazellkernen von transgenen Alzheimer-Mäusen (APPPS1/ 2) lokalisiert sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit ermöglichen neue Hypothesen bezüglich der Neurotoxizität des Aβ42. In der vorliegenden Studie wird die Hypothese aufgestellt, dass Aβ42 wt durch die spezifische Bindung an Promotoren als Transkriptionsinhibitor oder –aktivator wirksam wird. Die Dysregulation verschiedener Zielgene des Aβ42 könnte ein alternativer Mechanismus der durch Aβ42 wt induzierten Neurotoxizität sein.

It was reported that Aβ42 peptides are neurotoxic, although the exact mechanism remains still unclear. The aim of this project was to identify potential toxicity mechanisms, which provide information about the neurotoxic effectiveness of Aβ42 wt. In this study it could be demonstrated using ELISA, immunofluorescent microscopy and electron microscopy that Aβ peptides are taken up by living cells and finally translocate into the nucleus. The uptake of the peptides is in close connection with the peptide hydrophobicity. It was shown that the shorter, less hydrophobic peptides preferentially translocate better into the nucleus than the longer, hydrophobic peptides. Within the nucleus neurotoxic Aβ42 peptides bind specific to the promoter of LRP1 and KAI1. Aβ42 wt peptides recruite the adapter protein Fe65 and the histone- acetytransferase Tip60. The HES1 promoter was used as a control hence no interaction was detected. The Aβ42 wt binding to the promoters is in direct correlation with the mRNA levels. Neurotoxic Aβ42 wt lead to a decrease of the mRNA levels of LRP1 and KAI1, whereas the mRNA levels of HES1 are not affected. Interestingly, Aβ42 wt increases the mRNA levels of its own precursor APP. In contrast the shorter and longer non-toxic peptides (Aβ38, 40, 42 G33A and 43) did not affect mRNA levels of the examined genes. Using Illumina Microarray further genes were identified, which were affected by the neurotoxic Aβ42 wt peptide. The mRNA levels of six identified genes (ID1-3, IGFBP3/ 5, LMO4) were characterized via qRT-PCR and supported to be upregulated upon Aβ42 wt treatment. The localization of Aβ42 wt peptides within the nucleus was confirmed by TEM in in vivo mice brain slices. For the first time it was demonstrated that neurotoxic Aβ42 peptides are localized in both neuronal nuclei and in the nuclei of glia cells in a transgenic Alzheimer mouse model (APPPS1/ 2). In conclusion these results arise a new hypothesis concerning the neurotoxic mechanism of Aβ42 peptides. Aβ42 wt bind specific to promoters and act as repressors or activators of transcription. The desregulation of genes caused by the neurotoxic Aβ42 wt in the nucleus could be an alternative pathway of Aβ-induced neurotoxicity. This study postulates that Aβ42 wt tetramers or low-n oligomers induce the effect in gene regulation.