Systematische Analyse des mTOR-Signalweges und der Bcl-2-Genfamilie bei akuten myeloischen Leukämien

Abstract

Aberrationen innerhalb von Signalwegen, die an der Regulation von Zelltod und Zellüberleben beteiligt sind, spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Tumoren und deren Therapieresistenz. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher bei der akuten myeloischen Leukämie den mTOR-Signalweg und die Bcl-2-Genfamilie auf ihren prognostischen Einfluss und ihre Beteiligung an der Entstehung von Resistenzmechanismen zu untersuchen. Hierdurch sollte das Verständnis der der Krankheit zugrunde liegenden molekularen Veränderungen verbessert werden, was eine Voraussetzung für die Entwicklung und den Einsatz zielgerichteter Therapeutika darstellt. Dafür wurden mittels quantitativer Taqman-PCR systematisch (1) die Expressionen der wesentlichen bekannten Regulatoren, sowie ausgewählter Zielgene des mTOR-Signalwegs und (2) die komplette Bcl-2-Genfamilie zum Zeitpunkt der Erstdiagnose und, teilweise, des Rezidivs analysiert. Weiterhin wurde der FLT3- und NPM1-Mutationsstatus bestimmt, die Daten in Relation zu den zytogenetischen Risikogruppen gebracht und in Relation zum Krankheitsverlauf korreliert. Zusammenfassend ergaben sich bei den systematischen Genanalysen neue interessante Erkenntnisse zur Regulation von Zellüberleben und Proliferation durch NPM1 und den mTOR- Signalweg. Es ergaben sich erstmalig Hinweise darauf, dass Veränderungen im mTOR-Signalweg ursächlich an der günstigen Prognose einer NPM1-Mutation beteiligt sein könnten. Denn das Vorliegen einer NPM1-Mutation korrelierte mit hoher TSC2- und niedriger D-Typ-Cyclin-Expression, was für eine Inhibierung des mTOR-Signalweges durch den TSC1/2-Komplex spräche. Hohes TSC2 (Tuberin) und, in geringerem Ausmaß, hohes TSC1 (Hamartin) wiesen zudem ein längeres Gesamt- und krankheitsfreies Überleben sowie eine Reduktion der Genexpression im Rezidiv auf, was TSC zu einem interessanten Biomarker macht. Weiterhin ergaben sich neue wesentliche Einblicke in die Zelltodregulation durch die Bcl-2-Genfamilie. Eine extrem niedrige Nbk/Bik-Expression korrelierte mit einem verkürzten krankheitsfreien Überleben. Außerdem fanden wir signifikant höhere Nbk-Expressionswerte in der Subgruppe mit NPM1-Mutation, was ebenfalls auf eine Aktivierung des intrinsischen Apoptosesignalweges bei NPM1-Mutation hindeutet. Neben einer Reihe von weiteren Ergebnissen fanden wir bemerkenswerte Hinweise auf Mechanismen der Apoptoseresistenz im Rezidiv. Dabei scheint es durch die simultane Hemmung von Bak und Bax zu einer potenten Inhibierung der Apoptose zu kommen, worauf die Expressionszunahme der endogenen Bak-Inhibitoren Mcl-1 und Bfl1/A1 und die Reduktion der Bax- Expression im Rezidiv hindeutet.

Aberrations of signaling pathways which are involved in the regulation of cell death and cell survival play an important role in the development of cancers and cancer therapy resistance. Therefore the aim of this thesis was to analyze if in acute myeloid leukaemias the mTOR signaling pathway and/or the bcl-2 family had a prognostic influence or were involved in mechanisms of resistance. That knowledge is essential to improve our understanding of the molecular alterations of the disease which is a condition for the development and the use of targeted therapies. We measured by means of the quantitative Taqman-PCR the expression of (1) the most important regulators and selected target genes of the mTOR signaling pathway and (2) the whole bcl-2 family, both at diagnosis and partly at relapse. Furthermore we determined the mutational status of FLT3-ITD and NPM1. Then we correlated the gene expressions and the mutational status with the cytogenetic subgroups and looked for their prognostic influence. The systematic clinico-genetic analysis revealed interesting new findings about the regulation of cell death and cell survival by NPM1 and mTOR signaling. For the first time we found evidence that alterations of the mTOR pathway could be causal for the good prognosis of the NPM1 mutation. NPM1 mutations were correlated with high expressions of TSC2 and low expressions of Cyclin D1 and Cyclin D2, which might indicate an inhibition of the mTOR pathway by the TSC1/2 complex. High TSC2 (tuberin), and also to a lower degree high TSC1 (hamartin), showed a better overall survival and disease free survival as well as a reduction of the gene expression at relapse. This makes TSC to an interesting biomarker. Moreover we found new important insights into the regulation of cell death by the Bcl-2 family. A very low expression of Nbk/Bik correlated with a reduced disease free survival. Nbk/Bik expression was significantly higher in the subgroup with NPM1 mutation, which can be considered an indicative of an activation of the intrinsic apoptotic pathway in NPM1 mutated leukemic cancer cells. Amongst various other results we found very interesting indications of mechanisms of apoptotic resistance at relapse. The simultaneous inhibition of Bak and Bax seems to cause a potent inhibition of apoptosis, since at relapse we found an increase of the expression of the endogenous Bak-inhibitors Mcl-1 and Bfl1/A1 and a decline of the Bax expression.