Untersuchungen an mutmaßlichen Virulenzfaktoren von Trueperella bonasi und Trueperella bialowiezensis

Abstract

Männliche Wisente (Bison bonasus) im Waldgebiet von Białowieża in Polen und Weißrussland leiden seit den 1960er (Weißrussland) bzw. 1980er Jahren (Polen) unter der Balanoposthitis, einer chronisch-nekrotisierenden Entzündung des Präputiums und des Penis, die etwa 6,4% der Bullen in Polen betrifft. Die Ätiologie dieser Erkrankung ist nicht bekannt. Es wird jedoch vermutet, dass zwei Gram-positive Bakterien der Gattung Trueperella, T. bonasi und T. bialowiezensis, eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese spielen, da sie bereits in frühen Stadien der Erkrankung nachgewiesen wurden und bei gesunden Tieren nicht vorkommen. Um diese Idee zu überprüfen, wurde in der vorliegenden Arbeit nach möglichen Virulenzfaktoren bei T. bonasi DSM 17163 und T. bialowiezensis DSM 17162 gesucht: Neuraminidasen, Hämolysin, Phospholipase D und DNAsen. Hierbei dienten die nahe verwandten human- und tierpathogenen Schleimhaut- und Weichteilinfektionserreger T. pyogenes (DSM 20630) und A. haemolyticum (DSM 20595) als Vergleichsorganismen. Der MUAN-Filterpapier-Test zum Nachweis von Neuraminidasen ergab für beide Bakterienarten ein positives Ergebnis. Bei der Untersuchung der mit dieser Arbeit zum ersten Mal erstellten genomischen Bibliotheken wurden jedoch nur in der T. bonasi-Bibliothek Neuraminidasepositive Cosmidklone gefunden. Dies spricht dafür, dass die T. bialowiezensis-Cosmidbibliothek trotz großer Einzelklonanzahl (8x10³ Klone mit durchschnittlichen Insertlängen von 32.500 bp) nicht das vollständige Genom von T. bialowiezensis DSM 17162 abdeckt. Um die Größe der Neuraminidase-Domain zu bestimmen, wurden die Inserts der Neuraminidase-positiven T. bonasi- Cosmidklone nach Extraktion mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen verdaut, in einen Plasmidvektor subkloniert und erneut auf Neuraminidase-Aktivität geprüft. Mittels „primer walking“-Technik wurde der Neuraminidase-positive Plasmid-Klon bon/cos6A/pJET4A sequenziert. Auf dessen Insert befanden sich zwei Gene – zum einen ein 3.312 bp langes Gen, welches die Neuraminidase- Aktivität kodierte und zum anderen ein 1.161 bp langes Gen („bon-UPF“), das für ein Protein mit dem Molekulargewicht von 98.480 kodierte (T. bonasi-„UPF- ähnliches“ Protein) und aufgrund von SequenzÄhnlichkeiten in die Familie der „UPF0027/RtcB“-Proteine, also RNA-Ligasen bzw. der „Hint-Superfamilie“ (Hint = Hedgehog intein domain) eingeordnet wurde und sich in weiteren Subklonierungstests als nicht essentiell für die Neuraminidase-Aktivität erwies. Die Aminosäure (AS)-Sequenz der T. bonasi-Neuraminidase enthält, wie die aller bakteriellen Neuraminidasen, die konservierte RIP/RLP-Sequenz (Arg- Ile/Leu-Pro) sowie fünf Ausführungen des ASP-Box-Motives (Ser-X-Asp-X-Gly-X -Thr-Trp), von denen zwei bis fünf Ausführungen erwartet worden wären. Das Protein hat ein Molekulargewicht von 273.309. Die Sequenz der T. bonasi- Neuraminidase weist die größte Ähnlichkeit zur T. pyogenes-Neuraminidase NanH auf (44% Nukleotidsequenz-Übereinstimmung und 59% Aminosäuresequenz- Übereinstimmung), weshalb der Name „T. bonasi-Neuraminidase NanH“ vorgeschlagen wird. Viele bakterielle Neuraminidasen, so auch T. pyogenes NanH, sind als Virulenzfaktoren von Bedeutung und spielen bei der initialen Schädigung der Schleimhautoberfläche und dem somit erleichterten Anhaften der Bakterien an Wirtszellen eine Rolle. So wird vermutet, dass auch T. bonasi- Neuraminidase NanH ein Virulenzfaktor ist, der T. pyogenes NanH ähnliche Funktionen hat; dies sollte jedoch in zukünftigen Untersuchungen geklärt werden. Obwohl T. bonasi DSM 17163 und T. bialowiezensis DSM 17162 auf Schafblut-Agarplatten eine feine Hämolysezone um die Kolonien ausbildeten, erbrachten die in dieser Arbeit eingesetzten Tests (Hämolysintest, unterschiedliche PCR-Verfahren, DotBlot- und Southern Blot-Hybridisierungen, Screening der genomischen Cosmidbibliotheken auf Wisent- und anderen Tierblutagarplatten) keine Hinweise auf das Vorhandensein eines Hämolysins aus der Familie der MACPFs/CDCs („Membrane attack complex/Perforin- Family“/„Cholesterol dependent Cytolysins“). Tests auf Vorhandensein von Phospholipase D oder einer extrazellulären DNAse verliefen gleichfalls negativ. Auf Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit wird eine komplette Sequenzierung der Genome von T. bonasi und T. bialowiezensis für sinnvoll erachtet, da mit dieser Methode auch Virulenzfaktoren identifiziert werden könnten, die keinen bekannten Virulenzfaktoren verwandter Bakterien gleichen, beispielsweise ein neuartiges Hämolysin, das nicht zur MACPF/CDC- Superfamilie gehört. Bis dahin kann eine eindeutige Aussage zur Pathogenität der Bakterien als Auslöser der Balanoposthitis beim Wisent nicht getroffen werden.

Since the 1960s (Belarus) and the 1980s (Poland), male European bison (Bison bonasus) living in the Białowieża forest area suffer from balanoposthitis, a chronically necrotising inflammatory disease of the prepuce and penis, which affects approximately 6.4% of the bulls. The etiology of the disease is unknown, although two gram-positive bacteria from the genus Trueperella, T. bonasi and T. bialowiezensis, have been suspected to play a crucial role in the pathology of balanoposthitis, since they are already present at the early stages of the disease and are absent from healthy animals. The study reported in this thesis was therefore designed to identify possible virulence factors of T. bonasi DSM 17163 and T. bialowiezensis DSM 17162: neuraminidase, hemolysin, phospholipase D and desoxyribonuclease (DNAse). Two closely related bacteria responsible for soft tissue infections and infections of the mucous membranes in humans and animals, T. pyogenes (DSM 20630) and A. haemolyticum (DSM 20595), were used for comparisons. The MUAN-filter paper test detected neuraminidase activity in both bacteria strains. In this study two genomic cosmid libraries were constructed for the first time but only one of them – the genomic library of T. bonasi DSM 17163 – contained neuraminidase-positive cosmid clones. This suggests that the T. bialowiezensis DSM 17162 cosmid library, even though it contained 8x10³ clones with an average insert length of 32,500 bp, did not cover the entire genome of T. bialowiezensis DSM 17162. After extracting the neuraminidase-positive T. bonasi cosmid clones, fragments of the inserts were subcloned into a plasmid vector and again screened for neuraminidase activity. “primer walking” technique was then used to sequence the neuraminidase-positive clone bon/cos6A/pJET4A which contained an insert with two ORFs. One encoded a gene of 3,312 bp length encoding for the neuraminidase activity; the other one was a gene of 1,161 bp length (“bon- UPF”) which encoded for a protein (T. bonasi-„UPF-like“ protein) with the molecular mass of 98,480 and was assigned to the „UPF0027/RtcB“-protein family (RNA ligases) and the “Hint-superfamily” (Hint = Hedgehog intein domain), respectively. Further subcloning to separate the two genes showed that the presence of “bon-UPF” is not essential for neuraminidase activity. Like all bacterial neuraminidases, the amino acid sequence of the T. bonasi neuraminidase contains the conserved RIP/RLP (Arg-Ile/Leu-Pro) sequence as well as five copies of the ASP-Box motif (Ser-X-Asp-X-Gly-X-Thr-Trp), for which two to five are customary. The molecular mass of the protein is 273,309. The T. bonasi DSM 17163 neuraminidase has its highest sequence similarity to that of T. pyogenes neuraminidase NanH – they share 44% of their nucleotide sequence and 59% of their amino acid sequence. I therefore suggest the name “T. bonasi neuraminidase NanH” for the newly identified protein. Similar to many bacterial neuraminidases, T. pyogenes NanH acts as a virulence factor, playing an important role in the initial damaging of mucosal surfaces and thus facilitating bacterial colonization of host tissues. It is therefore assumed that T. bonasi NanH also constitutes a virulence factor with similar functions as T. pyogenes NanH although this needs to be investigated further. Although T. bonasi DSM 17163 and T. bialowiezensis DSM 17162 only showed a thin zone of hemolysis around their colonies when cultivated on domestic sheep-blood-agar plates, all tests applied failed to detect a hemolysin. These included the hemolysin test, different PCR-approaches, DotBlots, Southern blot hybridisations and the screening of the genomic cosmid libraries on blood agar plates of bison and other species. There was no evidence for the existence of a phospholipase D, nor for the presence of an extracellular DNAse. Future studies should include a complete genome sequencing of T. bonasi and T. bialowiezensis, as this would facilitate the detection of virulence factors which lack any similarity to any known virulence factor of related bacteria, for instance a novel hemolysin that does not belong to the MACPF/CDC- superfamiliy. Until then an unambiguous statement on the pathogenicity or otherwise of T. bonasi DSM 17163 and T. bialowiezensis DSM 17162 as the causative agent of the balanoposthitis in European bison is not feasible.