Der Einfluss von Cytokinin auf die Entwicklung des Sprossmeristems und auf den Ertrag von Arabidopsis thaliana und Brassica napus

Abstract

Pflanzen bilden während ihres gesamten Lebenszyklus immer wieder neue Organe. Die Organe des Sprosses werden vom apikalen Sprossmeristem (SAM) hervorgebracht. Das SAM enthält im Zentrum eine Stammzellengruppe, die durch Teilung beständig undifferenzierte Zellen an die Meristemperipherie abgibt, ohne sich selbst aufzubrauchen. An den Meristemrändern werden die abgegebenen Zellen in neu angelegte Organe eingegliedert, wo sie schließlich zu unterschiedlichen Gewebetypen differenzieren. Es besteht ein komplexes Netzwerk aus genetischen Faktoren und Pflanzenhormonen, das das dynamische Gleichgewicht aus Zellteilung-, -erhaltung und differenzierung kontrolliert. Das Pflanzenhormon Cytokinin spielt bei diesen regulativen Prozessen eine wichtige Rolle, die jedoch nur teilweise verstanden ist. Die cytokininabbauenden Enzyme CKX3 und CKX5 sind im SAM aktiv. In ckx3 ckx5 Mutanten sind beide Enzyme inaktiv, was einen Anstieg des Cytokiningehalts im Sprossapex bewirkt. Dies führt zu einer Vergrößerung des SAM und zu einer Steigerung der Produktivität, d.h. die Primordienbildung ist beschleunigt. Im ersten Teilprojekt dieser Arbeit wurde gezeigt, dass dieser Phänotyp durch das Einkreuzen der ahp6 Mutation verstärkt werden kann. AHP6 ist ein negativer Regulator der Cytokininsignaltransduktion, der, wie hier durch In-situ- Hybridisierungen nachgewiesen wurde, am Entstehungsort zukünftiger Primordien aktiv ist. Die ckx3 ckx5 ahp6 Pflanzen bildeten am deutlich vergrößerten Hauptmeristem ca. 40 % mehr Primordien als ckx3 ckx5 Pflanzen und mehr als doppelt so viele Primordien wie der Wildtyp. Dies schlug sich jedoch nicht in der Zahl der Schoten wieder. Auf die ganze Pflanze bezogen bildeten ckx3 ckx5 ahp6 Mutanten weniger als halb so viele Schoten wie der Wildtyp, obwohl sie am Hauptspross ca. 15 % mehr Schoten anlegten. Die geringe Gesamtschotenzahl ist auf einen Rückgang der Verzweigungen um fast 80 % zurückzuführen. Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde die Wirkung von Cytokinin in verschiedenen Bereichen des SAM untersucht. Dafür wurden neun verschiedene Promotor-Gen- Konstrukte kloniert, die (nach der Transformation in Arabidopsis) in eng begrenzten Domänen des SAM den Cytokininstatus anheben oder absenken sollten. Dafür wurden drei Promotoren ausgewählt: pCLV3 ist in den Stammzellen (SZ) aktiv, pWUS im organisatorischen Zentrum (OZ) und pCLV1 in einem größeren Bereich des Meristemzentrums, der sowohl das OZ als auch Teile der Stammzellen und der Peripheren Zone (PZ) umfasst. Die Promotoren wurden mit CKX1, ARR1-SRDX oder ROCK2 kombiniert. CKX1 ist ein Cytokinin abbauendes Enzym, ARR1-SRDX hemmt die Cytokininsignaltransduktion und ROCK2 ist ein konstitutiv aktiver Cytokininrezeptor. Alle neun Konstrukte wurden stabil in Arabidopsis transformiert und die Transkription aller Transgene wurde nachgewiesen. Die Expression von pCLV3:CKX1, pCLV3:ARR1-SRDX, pWUS:CKX1 oder pWUS:ARR1-SRDX bewirkte keine Änderung des Phänotyps. Dagegen waren sowohl die pCLV1:CKX1 als auch die pCLV1:ARR1-SRDX Pflanzen deutlich kleiner als der Wildtyp. Diese Phänotypen sind z.T. vermutlich auf die Aktivität des pCLV1 Promotors im Leitgewebe von Spross und Blättern zurückzuführen. pCLV1:ARR1-SRDX Pflanzen stellen unter Selektionsstress häufig die Aktivität des vegetativen Hauptmeristems ein. Vermutlich geschieht dies auch in nicht-gestressten Pflanzen, da diese buschige Rosetten und eine Vielzahl von gleichzeitig wachsenden Infloreszenzsprossen bilden. pCLV1:ROCK2 Pflanzen entwickelten kleine eingerollte Blätter, kurze Infloreszenzsprosse und leicht vergrößerte Infloreszenzen. Während die Blattform bzw. die Sprosslänge vermutlich durch die pCLV1-Aktivität im Leitgewebe begründet ist, bewirkt das konstitutive Cytokininsignal im SAM, gemessen an der Blütendichte, vermutlich eine Vergrößerung des Sprossapex. Das konstitutive Cytokininsignal im OZ verursachte in den extremsten Fällen die Bildung eines stark vergrößerten, kugelförmigen Apex, der, abgesehen von wenigen kleinen Blättern, weder in der Lage war, laterale Organe zu bilden, noch in die Länge zu wachsen. Offensichtlich ist bei diesen Pflanzen das Gleichgewicht aus Zellteilung und –differenzierung gestört. Stark exprimierende pWUS:ROCK2 Pflanzen haben große Ähnlichkeit pCLV3:DRN Pflanzen. DRN kodiert für einen Transkriptionsfaktor. Es wird vermutet, dass das Gen positiv durch Cytokinin reguliert wird. Möglicherweise wird DRN in pWUS:ROCK2 Pflanzen ektopisch aktiviert. Die auffälligsten Merkmale der pCLV3:ROCK2 Pflanzen waren das weitgehende Fehlen von Seitensprossen und das extrem vergrößerte, stark deformierte SAM, das eine Vielzahl von Blütenprimordien anlegte. Das Infloreszenzmeristem bildete sowohl fertile, vergrößerte Blüten, als auch filiformer grüne Organe, die vermutlich missgebildete Blüten waren. Kreuzungsexperimente zeigten, dass der transgene Phänotyp abhängig von STM und WUS war und durch die clv3 Mutation verstärkt wurde. In der Vergangenheit war gezeigt worden, dass ckx3 ckx5 Arabiodpsismutanten mehr Samen bilden können als Wildtyppflanzen. Raps ist eine allotetraploide Nutzpflanze, die nah mit Arabidopsis verwandt ist. Im Genom von Raps existieren vier CKX3- und zwei CKX5-Kopien. Im dritten Teilprojekt dieser Arbeit wurden transgene Rapspflanzen hergestellt, deren CKX3 und CKX5 Transkriptmenge durch die Expression von amiRNAs reduziert war. Obwohl eine leichte Vergrößerung des Infloreszenzmeristems beobachtet wurde, konnte keine Ertragssteigerung festgestellt werden. Im Gegenteil produzierten die transgenen Pflanzen gleichviele oder weniger Samen als die Kontrollpflanzen. Da die Ertragsversuche unter suboptimalen Gewächshausbedingungen durchgeführt wurden, sind diese Ergebnisse jedoch kaum belastbar.

Plants initiate new organs throughout their life cycle. The organs of the shoot are produced by the shoot apical meristem (SAM). In its centre, the SAM maintains a group of continuously dividing stem cells (SC) that provide cells for the meristem periphery without using themselves up. At the meristem borders the stem cell descendants are incorporated into organ primordia. In the course of organ development the cells finally differentiate into different tissue types. A complex network of genetic factors and plant hormones controls the dynamic balance of cell division, maintenance and differentiation. The phytohormone cytokinin is involved in these processes, but its function is only partially understood. The cytokinin degrading enzymes CKX3 and CKX5 are active in the SAM. In the ckx3 ckx5 mutant the loss of both enzymes causes an elevated cytokinin content in the SAM. This leads to an enlargement of the SAM and an increased rate of primordium initiation. In the first subproject of this work it was shown, that this phenotype is even more pronounced in the ahp6 ckx3 ckx5 triple mutant. AHP6 is a negative regulator of cytokinin signal transduction. It was confirmed by in situ hybridizations that AHP6 is expressed at the position of future primordia. ckx3 ckx5 ahp6 mutants had an enlarged SAM, producing about 40 % more primordia than the ckx3 ckx5 mutant and more than twice the number of primordia than the wildtype. Silique number at the main stem was increased by 15 % in triple mutants. Nonetheless overall number of siliques was decreased by more than 50 % when compared to the wildtype, which was due to the low number of lateral branches. The second subproject was designed to investigate the impact of cytokinin on different regions of the SAM. Nine different promoter-gene constructs were cloned to alter the cytokinin status in specific meristem domains of Arabidopsis. To this end three meristem domain specific promoters were chosen: pCLV3 is active in the SC, pWUS in the organizing centre (OC) and pCLV1 is expressed in a domain comprising the OC, the lower part of the SC and the inner peripheral zone. Each of the promoters was combined either with CKX1, ARR1-SRDX or ROCK2. CKX1 is a cytokinin degrading enzyme, ARR1-SRDX is a suppressor of cytokinin signalling and ROCK2 is a constitutively active cytokinin receptor. The nine constructs were transformed into Arabidopsis and transcription of all transgenes was confirmed. Plants expressing pCLV3:CKX1, pCLV3:ARR1-SRDX, pWUS:CKX1 or pWUS:ARR1-SRDX showed no phenotypic alterations. In contrast, both pCVL1:CKX1 and pCLV1:ARR1-SRDX plants were smaller than the wildtype. To some extent this phenotype is probably due to the activity of the CLV1 promoter in the vasculature of the stem and leaves. When selected on kanamycin pCLV1:ARR1-SRDX plants frequently terminated their vegetative SAM and initiated a great number of lateral rosettes which gave them a bushy appearance. In non-selected plants the terminated SAM was not readily visible between leaves. However this kind of meristem arrest probably also occurs in non-selected plants, as they also develop bushy rosettes and initiate many inflorescence stems simultaneously. pCLV1:ROCK2 had small involute leaves, short crooked inflorescence stems and slightly enlarged inflorescences. Stem length and leaf form were probably caused by the activity of the transgene in the vasculature whereas the enlarged inflorescence apex is possibly due to the constitutive cytokinin signal in the SAM. The constitutive cytokinin signal in the OC of pWUS:ROCK2 plants caused a severe phenotype. Transgenic plants only produced a few leaves and never bolted. Instead they formed a small globular shoot covered with trichomes. Obviously the balance between cell proliferation and differentiation was disturbed. pWUS:ROCK2 plants resembled pCLV3:DRN plants. DRN encodes a transcription factor and is probably induced by cytokinin. Possibly the pWUS:ROCK2 transgene causes ectopic expression of the DRN gene. pCLV3:ROCK2 plants hardly formed lateral branches. The enlarged and distorted SAM initiated a great number of flowers. Flowers were either enlarged or had the shape of green filiform structures lacking floral organs. Crosses with meristem mutants revealed both STM and WUS to be epistatic to the transgene. In contrast, the clv3 mutation potentiates the meristematic phenotype. ckx3 ckx5 Arabidopsis mutants produce more seeds than wildtype plants. The genome of canola, a polyploid crop plant closely related to Arabidopsis, harbours four CKX3 and two CKX5 gene copies. The last subproject of this thesis aimed to reduce the content of CKX3 and CKX5 transcript in the canola cultivar Mozart by expression of different amiRNA transgenes. Quantitative real time PCR analysis showed successful down regulation of target gene transcripts in transgenic canola plants. Scanning electron microscope pictures of shoot apices revealed a slight increase of meristem size. In spite of the increased SAM size no increase in seed yield was observed. Instead, amiRNA expressing plants produced less seeds than wildtype plants or the same amount of seeds.