Regulation von insulin-like growth factor binding protein 5 (IGFBP5) durch den Wilmstumor Transkriptionsfaktor WT1: Mechanismen und pathophysiologische Konsequenzen

Abstract

Das Wilmstumorgen WT1 kodiert für einen Tumorsuppressor, bei dessen Funktionsverlust es zur Ausbildung von Wilmstumoren, frühkindlichen Nierentumoren, kommen kann. Durch Translation alternativ gespleisster WT1-Transkripte entstehen verschiedene Proteinisoformen, von denen manche als Transkriptionsfaktoren wirksam sind, während andere vermutlich bei der posttranskriptionellen mRNA-Prozessierung eine Rolle spielen. WT1 ist entscheidend an der embryonalen Organogenese beteiligt und notwendig für die normale Entwicklung von Nieren, Gonaden und Mesothel. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass WT1 auch für die Funktion bestimmter Organe im erwachsenen Organismus erforderlich ist. Die Inaktivierung von WT1 in adulten Mäusen verursacht eine schwere Osteoporose. Weiterhin fiel bei diesen Mäusen eine verminderte Serumkonzentration von IGF-I auf. Eine genomweite Microarray- Analyse zeigte eine enge Korrelation zwischen den mRNA-Niveaus von WT1 und IGFBP5. IGFBP5 ist eines von sechs IGF-bindenden Proteinen, gehört der IGF- Achse an und ist ein wichtiger Regulator der IGF-Aktivität im Knochen. Außerdem wird das Protein in einer Vielzahl von Tumoren exprimiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Lokalisation von IGFBP5 im embryonalen (Maus, Ratte) und adulten Organismus (Maus, humane Zelllinien) untersucht. In der vorliegenden Arbeit sollte überprüft werden, ob eine Korrelation zwischen der Expression von WT1 und IGFBP5 besteht. Weiterhin sollten die molekularen Mechanismen einer möglichen Regulation der IGFBP5-Expression durch WT1 analysiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass WT1 und IGFBP5 in verschiedenen Zelllinien koreguliert werden. Mittels siRNA-Knockdown wurde nachgewiesen, dass die Expression von Igfbp5 in murinen Mesonephroszellen Wt1-abhängig erfolgt. Die Induktion von WT1 in UB27-Osteosakomzellen führte zu einer Hochregulierung von IGFBP5-mRNA und IGFBP5-Protein. Durch eine in- silico-Analyse ließen sich vier potenzielle WT1-Bindungsstellen im IGFBP5-Promotor identifizieren. Hinweise auf eine mögliche Regulation des IGFBP5-Gens durch Sauerstoffmangel lieferte die Identifizierung eines HIF-1-Bindungsmotivs. Mit Hilfe von Reportergenassays konnte gezeigt werden, dass die transkriptionell wirksame WT1(-KTS)-Variante den IGFBP5-Promotor aktiviert. WT1(+KTS)-Protein, das vermutlich an der posttanskriptionellen mRNA-Prozessierung beteiligt ist, hatte hingegen keinen signifikanten Einfluss auf die Promotoraktivität. Mittels Chromatin-Immunpräzipation wurde die Bindung von WT1(-KTS) an den IGFBP5-Promotor in UB27-Zellen in vivo überprüft. In Osteosarkom- und in Neuroblastomzellen ließ sich die Expression von IGFBP5 durch Hypoxie stimulieren. Mittels quantitativer RT-PCR wurde die IGFBP5-mRNA in verschiedenen Organen der adulten Maus ermittelt. Eine besonders starke Expression zeigten Herz, Niere, ZNS und Skelettmuskel. Mittels Immunhistochemie ließ sich IGFBP5 in der embryonalen Niere und im Knochen der Ratte darstellen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die IGFBP5-Expression durch den Wilmstumor-Transkriptionsfaktor reguliert wird. Dieser Regulationsmechanismus scheint vor allem im normalen und pathologisch veränderten Knochen eine Rolle zu spielen, die es weiter zu charakterisieren gilt.

The Wilms’ tumor gene, WT1, encodes a zinc finger transcription factor that functions as a tumor suppressor and key regulator of developmental processes. WT1 encodes several protein isoforms, of which WT1(-KTS) acts as a transcriptional regulator, while WT1(+KTS) is involved in RNA-processing. Recent findings indicate that WT1 is necessary for maintaining physiological bone integrity in the adult organism. Insulin-like growth factor binding protein-5 (IGFBP5) is one of six IGF-binding proteins, member of the IGF- family and also involved in osteogenesis and bone metabolism. As WT1, IGFBP5 is expressed in a number of malignant tumors. In the present study, we aimed at clarifying the role of IGFBP5 as a novel candidate target gene of WT1. Genome-wide cDNA-microarray-analysis revealed a close correlation between the mRNA-levels of WT1 and IGFBP5. While IGFBP5 is mainly expressed in kidney and muscle tissues, WT1- and IGFBP5-proteins were co-localized by immunohistochemistry in the kidney and bone of embryonic rats and mice. siRNA- mediated silencing of Wt1 in the murine mesonephros-derived cell line M15 reduced Igfbp5-mRNA-levels by approximately 80% compared to a non-targeting siRNA. IGFBP5-transcripts- and IGFBP5–protein-levels were increased significantly in osteosarcomacells expressing the transcriptionally active WT1(-KTS)-protein. In contrast, the WT1(+KTS)-isoform, which has a presumed role in mRNA-processing rather than in transcriptional regulation, did not significantly change IGFBP5-expression in these cells. Bioinformatic analysis revealed four putative WT1-binding-sites in the 5´-flanking region of the human IGFBP5-gene. Reporter-gene-assays showed that WT1(-KTS) activates the IGFBP5-promoter, while WT1(+KTS) did not show any significant effect. By gradual shortening of the IGFBP5-promoter-construct, which abolished the putative WT1-binding-elements, this effect was abrogated. Chromatin- immunoprecipitation verified WT1 binding to the IGFBP5-promoter in vivo. Moreover, several hypoxia-responsive-elements (HREs = binding sites of hypoxia-inducible factors) could be detected, which is especially relevant given the hypoxic regulation of both WT1 itself and a number of its target genes. Indeed, expression of IGFBP5 in osteosarcoma and neuroblastoma cells was stimulated by hypoxia. These findings indicate that IGFBP5 may act as a novel downstream effector of WT1 with potential roles in both normal and pathological bone-related processes, which remain to be elucidated.