dc.contributor.author
Geibel, Sebastian
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:28:09Z
dc.date.available
2011-01-11T11:21:41.657Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13399
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17597
dc.description
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III 1 EINLEITUNG 1 1.1 Primasen sind essentielle
Komponenten der DNA-Replikation 1 1.2 Katalytischer Mechanismus der Nukleotid-
Addition von Polymerasen 2 1.3 Mechanismus der Primersynthese 2 1.4 IncQ-
Plasmide als Modellsysteme. 3 1.5 Genstruktur des Plasmids RSF1010 4 1.6
RSF1010 repliziert im leading strand Modus 5 1.7 Mobilisierung von RSF1010
durch bakterielle Konjugation 8 1.8 Primase RepB‘ - ein hochspezialisiertes
essentielles Replikationsenzym 9 1.9 Unterteilung bekannter Primase-
Raumstrukturen in zwei Klassen 10 1.10 Raumstrukturen von DnaG-Typ Primasen
bestehen aus drei Domänen 10 1.11 Die Zink-Ribbon Domäne ist essentiell für
DnaG-Typ Primaseaktiviät 11 1.12 Die RNA-Polymerase Domäne- das katalytische
Zentrum der DnaG-Typ Primasen 12 1.13 Pri-Typ Primasen bestehen aus zwei
Komponenten 12 1.14 Primase-DNA-Strukturen lassen mechanistische Schlüsse zu
14 1.15 Biochemische Eigenschaften von Pri- und DnaG-Typ Primasen:
Primersynthese, DNA-Erkennung 15 1.16 Aufgabenstellung 17 2 MATERIALIEN 18 2.1
Geräte 18 2.2 Materialien für die Kristallisation und Röntgen-
Beugungsexperimente 19 2.3 Chemikalien, Puffer, Nährmedien und –böden 19 2.4
Bakterien- und Phagenstämme 20 2.5 Plasmide und Oligonukleotide 21 2.6 Längen-
und Molekulargewichtsstandards 22 2.7 Enzym 22 3 METHODEN 23 3.1 Molekulare
Klonierung der RepB’-Derivate Gene 23 3.1.2 DNA-Isolierung aus Agarosegelen 24
3.1.3 Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen 24 3.1.4 DNA-Ligation 24
3.1.5 Transformation 24 3.1.6 Plasmidpräparation 25 3.1.7 In vitro DNA-
Mutagenese 25 3.1.8 DNA-Sequenzierung 25 3.1.9 Stammkonservierung 25 3.2
Herstellung und Präparation der RepB’-Derivate und des Primase-DNA-Komplexes
25 3.2.1 Vorkulturen 25 3.2.2 Protein-Überexpression 26 3.2.3 Zellaufschluss
26 3.2.4 Ultrazentrifugation 26 3.2.5 Chromatographische Proteinreinigung 26
3.2.6 Kationenaustausch-Chromatographie an Heparin 26 3.2.7 Kationenaustausch-
Chromatographie an Sulfopropylgruppen 27 3.2.8 Größenausschluss-
Chromatographie an Superdex-75 27 3.2.9 Reinigung der N- und C-terminalen
Domäne von RepB‘ 27 3.2.10 Herstellung und Reinigung der Primase-DNA-Komplexe
27 3.3 Herstellung zirkulär geschlossener einzelsträngiger (ss) und
doppelsträngiger (ds) DNA des Phagen M13mp18ssiA 28 3.3.1 Transformation von
E. coli JM103 mit M13mp18ssiA dsDNA 28 3.3.2 Kultivierung des Indikator-
Stammes E. coli JM103 28 3.3.3 Infektion des Indikator-Stammes E. coli JM103
mit dem Phagen M13mp18ssiA 28 3.3.4 Anzucht infizierter E. coli JM103-Zellen
(M13mp18ssiA+) zur Herstellung der dsDNA des Phagen M13mp18ssiA 29 3.3.5
Extraktion der ssDNA des Phagen M13mp18ssiA 29 3.3.6 Ethanolfällung von DNA 30
3.4 Allgemeine Biochemische Methoden 30 3.4.1 Agarosegel-Elektrophorese von
DNA 30 3.4.2 Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) von DNA 30
3.4.3 Diskontinuierliche SDS-Gelelektrophorese von Proteinen 31 3.4.4
Konzentrationsbestimmungen von DNA und Protein 31 3.4.5 Bradfort-Test 32 3.5
Proteincharakterisierung 32 3.5.1 MALDI-TOF Massenspektrometrie 32 3.5.2
Komplementärstrangsynthesetest 32 3.5.3 Primersynthesetest 33 3.5.4
Autoradiographie 33 3.5.5 Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA) mit
Wildtyp RepB’ und katalytischer Domäne von RepB’ 34 3.5.7 Analytische
Ultrazentrifugation 35 3.6 Kristallographische Methoden 35 3.6.1
Kristallisation 35 3.6.2 Beugungsexperimente, Datenaufnahme und –prozessierung
35 3.6.3 Lösung des Phasenproblems (RepB’-Raumstruktur) 36 3.6.4 Lösung des
Phasenproblems (Raumstruktur des Primase-DNA-Komplexes) 36 3.6.5
Modellverfeinerung, -bau und -validierung 36 3.6.6 Programme für die
dreidimensionale Strukturüberlagerung. 37 4 ERGEBNISSE 38 4.1 RepB’ beginnt
die Synthese des DNA-Primers an Thymin 32 der ssiA DNA-Sequenz 38 4.1.1 Die
Länge des von RepB’ synthetisierten DNA-Primers ist abhängig von der dATP
Konzentration und variiert zwischen 2-12 Nukleotiden 41 4.2 Strukturbestimmung
des Wildtyps RepB’ 43 4.2.1 Optimierung der Kristallisationsbedingung von
RepB’ 43 4.2.2 Aufnahme eines nativen Datensatzes bis zu einer Auflösung von
2,0 Å und Eingrenzung der tetragonalen Raumgruppen des RepB’-Kristalls auf
P41212 oder P43212 43 4.2.3 Darstellung der OsO3 x 2 Pyridin-Derivate von
RepB’ und Aufnahme von MAD-Daten bis zu einer Auflösung von 2,7 Å. 44 4.2.4
Erstellung des Raumstrukturmodells von RepB’ 44 4.3 RepB’ besteht aus zwei
flexibel miteinander verbundenen Domänen 46 4.4 Die katalytischen Zentren von
RepB’ und archaebakteriellen Primasen weisen Strukturhomologien auf 47 4.5 Die
Raumstrukturen von RepB’ und Pri-Typ Primasen weisen konservierte katalytische
Aminosäuren im aktiven Zentrum auf 48 4.6 Die RepB’-Aktivität ist Zink-Ionen
unabhängig 51 4.7 Die Helix-Bündel Domäne von RepB’ ist essentiell für die
Primase-Aktivität 52 4.8 Die Verkürzung des Aminosäurelinkers (AS 206-220) von
RepB’ reduziert die Primase-Aktivität 53 4.9 Die Helix-Bündel Domäne von RepB’
weist eine Homeodomänen-ähnliche Faltung auf 55 4.10 Die Helix-Bündel Domäne
von RepB’ bindet an ssiA DNA 56 Kartierung funktioneller Aminosäuren der
Helix-Bündel Domäne von RepB’ 57 4.11 Kristallisationsstrategien von Primase-
DNA-Komplexe 59 4.12 Das einzelsträngige 5’-Ende der ssiA DNA ist essentiell
für die Bindung an RepB’ 59 4.13 Herstellung des Primase-DNA-Komplexes 61 4.14
Kristallisation des Primase-DNA-Komplexes 61 4.15 Kristallstruktur der
katalytischen Domäne im Komplex mit ssiA(3’Δ13)DNA bei 2,7 Å Auflösung 61 4.16
Die Raumstruktur des Primase-DNA-Komplexes zeigt eine spezifische ssiA DNA-
Bindungsstelle von RepB’ 63 4.17 Die ssiA DNA-Haarnadelschleife enthält ein
G-T wobble Basenpaar 66 4.18 Die katalytische Domäne von RepB’ besteht aus
einer spezifischen ssiA DNA-Bindungs- und einer katalytischen Unterdomäne 67
4.19 RepB’ ist der Prototyp einer eigenen Primaseklasse, die ausschließlich im
leading strand Replikationsmodus arbeitet 68 5 DISKUSSION 73 5.1 Einordnung
der Primersynthese von RepB’ 73 5.2 RepB’ besitzt eine spezifische
Bindungsstelle für dATP zur Initiation der Primersynthese und eine dNTP-
Bindungsstelle zur Primerverlängerung 74 5.3 Das von Charles C. Richardson
vorgeschlagene Modell zur Initiation der Primersynthese von Primasen lässt
sich auf RepB’ anwenden 74 5.4 Primer-Initiations- und -Elongationsstelle
liegen im katalytischen Zentrum und lassen sich nicht unterscheiden 75 5.5
Mögliche DNA-Bindungsstellen der Helix-Bündel Domäne 75 5.6 Der
Aminosäurelinker von RepB’ erlaubt den Übergang von der offenen in die
geschlossene Konformation 76 5.6 Die Primaseaktivität von RepB’ und DnaG-Typ
Primasen erfordert zwei Domänen 76 5.7 Die Helix-Bündel Domäne ist spezifisch
für IncQ-Primasen 77 5.8 Die ssiA spezifische Unterdomäne I von RepB‘ könnte
als Ersatz für ein fehlendes Zink-Bindungsmotiv dienen 77 5.10 Modell für die
Translokation der ssiA DNA entlang RepB’ 78 5.11 Vergleich der RepB‘-DNA-
Erkennungssequenz ssiA mit Primase-DNA-Erkennungssequenzen pro- und
eukaryontischer Primasen 81 5.12 RepB‘ könnte einen Komplex mit dem
Kopplungsprotein des T4SS bilden 82 5.13 Evolutionären Herkunft von RepB’ 82 6
ZUSAMMENFASSUNG+SUMMARY. 84 7 LITERATUR 85 8 ANHANG 90 8.1 Planung der
RepB’-Derivate 90 8.2 Säulen-Chromatographische Reinigung der RepB’-Derivate
95 Curriculum vitae, Publikationen, Präsentationen 97 DANKSAGUNGEN 98
dc.description.abstract
Die Primase RepB’ des Plasmides RSF1010 initiiert jeweils an den Sequenzen
ssiA und ssiB im oriV die RSF1010-Replikation, die ausschließlich im leading
strand Modus erfolgt. Die beiden einzelsträngigen ssi Sequenzen bestehen aus
40 Nukleotiden und bilden Haarnadelstrukturen (nt 7-27) aus. In der
vorliegenden Arbeit wurde bestimmt, dass RepB’ die Synthese eines DNA-Primers
dATP-abhängig an Thymin 32 der ssiA-Sequenz beginnt. Die Raumstruktur von
RepB’ wurde in Volllänge bei einer Auflösung von 2,0 Å und die Struktur der
katalytischen Domäne von RepB’ (AS 1-212) im Komplex mit ssiA(3’Δ13)DNA (nt
1-27) bei einer Auflösung von 2,7 Å aufgeklärt. RepB’ zeigt eine hantelförmige
Struktur, die aus einer N-terminalen katalytischen und einer C-terminalen
Helix-Bündel Domäne besteht. Beide Domänen von RepB’ sind durch einen
flexiblen Aminosäurelinker aus 14 Aminosäuren verknüpft und liegen in der
Kristallstruktur ~29 Å voneinander entfernt. Die Struktur der katalytischen
Domäne von RepB’ (AS 1-212) im Komplex mit ssiA(3’Δ13)DNA zeigt, dass die
sechs 5’-terminalen Nukleotide und das erste Basenpaar der ssiA(3’Δ13)DNA
spezifisch von der Unterdomäne I der katalytischen Domäne gebunden werden.
EMSA-Studien belegten, dass das spezifisch gebundende 5’-Ende der ssiA DNA
essentiell zur Bindung von ssiA DNA an RepB’ ist. Die RepB’-ssiA(3’Δ13)DNA-
Struktur zeigt erstmals eine Primase im spezifischen Komplex mit DNA.
Struktur-Funktionsanalysen demonstrierten, dass die katalytische Domänen von
RepB’ und der eukaryontischen/archaebakteriellen Pri-Typ Primase Familie eine
ähnliche Faltung aufweisen und untereinander konservierte katalytische
Aminosäuren besitzen. Allerdings fehlt der katalytischen Domäne von RepB’ ein
für die Pri-Typ Primase-Familie typisches Zink-Bindungselement, das vermutlich
die Bindung an Matrizen-ssDNA unterstützt. Die spezifisch DNA-bindenden
Aminosäuren von RepB’ sind in Pri-Typ Primasen nicht konserviert. Die
Raumstruktur von RepB’ ist das erste Beispiel einer Zink-unabhängigen Primase-
Struktur. Komplementationsstudien bewiesen, dass die Helix-Bündel Domäne der
katalytischen Domäne von RepB’ Primaseaktivität verleiht. Die Helix-Bündel
Domäne wird in keiner anderen Primase-Raumstruktur vorgefunden und tritt nur
innerhalb von IncQ-Primasen auf. Aminosäuresequenzvergleiche zeigten, dass
RepB’ der Vertreter einer eigenen Primaseklasse ist, die von IncQ und IncQ-
ähnlichen Plasmiden kodiert wird, die ssiA- und ssiB Sequenzen tragen und hohe
Sequenzidentität zu RSF1010 besitzen.
de
dc.description.abstract
Primase RepB’ of plasmid RSF1010 initiates the replication of plasmid RSF1010
within the origin of vegetative replication (oriV) on sequences ssiA (ssi,
single strand initiator) and ssiB. Replication of RSF1010 is carried out
exclusively in leading strand mode. Sequences ssiA and ssiB consist of 40
nucleotides whilst nucleotides 7-27 form a double-stranded hairpin. This work
shows that RepB’ synthesises DNA primers with a length of up to 14 nucleotides
in a dATP dependent manner beginning on thymine 32 of ssiA DNA. The crystal
structure of RepB’ was determined in full length at 2.0 Å resolution and the
structure of the catalytic domain of RepB’ (amino acids 1-212) in a specific
complex with ssiA(3’Δ13)DNA at 2.7 Å resolution. RepB’ has got a dumbbell like
shape consisting of an N-terminal catalytic and a C-terminal helix-bundle
domain. Both domains of RepB’ are separated by a long α-helix and a flexible
linker composed of 14 amino acids and are found ~29 Å away from each other in
the crystal structure of RepB’. The structure of the catalytic domain of RepB’
in complex with ssiA(3’Δ13)DNA shows that nucleotides one to six and base pair
C7-G27 of the hairpin are specifically bound by subdomain I of the catalytic
domain. EMSA-studies confirmed that the six 5’ terminal nucleotides of ssiA
DNA are crucial for binding to RepB’. The structure of the catalytic domain-
ssiA(3’Δ13)DNA complex shows for the first time a primase in a specific
complex with DNA. Structure function analyses revealed that the catalytic
domains of RepB’ and of the eucaryotic/ archaebacterial Pri-type primase
family share a similar fold and conserved catalytic amino acids. However, the
catalytic domain of RepB’ lacks the zinc binding element typical of Pri-Typ
primases which is supposed to support DNA binding. The ssiA DNA binding amino
acids of RepB’ are not conserved among Pri-Typ primases. The structure of
RepB’ is the first structure of a zinc independent primase. Complementation
studies demonstrated that the catalytic domain of RepB’ exhibits primase
activity only in presence of the helix-bundle domain of RepB’, which occurs
exclusively among primases encoded by IncQ and IncQ-like plasmids. Amino acid
sequence comparisons showed that RepB′ is apparently the prototype of a
distinct class of primases encoded by IncQ and IncQ-like plasmids with ssiA-
and ssiB-like sequences, and exclusive leading-strand replication mode.
en
dc.format.extent
VI, 99 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
DNA replication
dc.subject
helix bundle domain
dc.subject
leading strand modus
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::572 Biochemie
dc.title
Struktur und Funktion der vom Plasmid RSF1010 kodierten Primase RepB’
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Udo Heinemann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wolfram Saenger
dc.date.accepted
2010-09-10
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000020632-0
dc.title.translated
Structure and function of primase RepB' encoded by plasmid RSF1010
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000020632
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000008811
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access