Effect of metformin on growth of differentiated thyroid cells and thyroid carcinoma cells and their derived cancer stem cells: implication for metformin as adjuvant treatment for undifferentiated thyroid cancer

Abstract

Insulin resistance and consecutive hyperinsulinemia and are the major reasons for a higher prevalence of several cancer entities in type 2 diabetes mellitus and obesity. Insulin exerts its growth-promoting effect via activation of insulin receptor- and insulin-like growth factor (IGF) receptor-dependent signaling. Metformin, an oral anti-diabetic drug, exerts a growth-inhibitory effect by reducing hyperinsulinemia and by a direct cellular action. This dual mode of metformin action is the rationale to consider metformin as a potential drug for adjuvant anti-cancer therapy. The aim of the present work was (1) to identify whether metformin exerts an anti-mitogenic effect on differentiated human thyroid cells and on thyroid carcinoma cells, and to elucidate the underlying mechanism at the cellular level, (2) to prove that metformin targets cancer stem cells in a doxorubicin-resistant anaplastic thyroid carcinoma cell line which are enriched with cancer stem cells, (3) to investigate the effect of metformin on insulin-mediated cell growth, and to find out if metformin inhibits growth by activation of the AMPK pathway, and if it antagonizes the growth stimulatory effect of insulin by inhibition of MAP kinase pathway, (4) to detect whether metformin is capable of amplifying the anti-mitogenic effect of chemotherapeutic agents such as doxorubicin and cisplatin on undifferentiated thyroid carcinoma cells. The study was performed in differentiated human thyroid cells, anaplastic thyroid carcinoma cells, a doxorubicin-resistant thyroid carcinoma cell line and thyroid cancer stem cells. The anti-mitogenic effect of metformin was studied in thyroid cells derived from goiters and in thyroid carcinoma cell lines by analysis of cell growth, cell cycle progression and apoptosis. Furthermore, the influence of pretreatment with insulin or with chemotherapeutic agents on metformin-induced growth inhibition was investigated in thyroid carcinoma cells, in a doxorubicin-resistant thyroid carcinoma cell line and in derived carcinoma stem cells. This work demonstrated that metformin exerted an anti-mitogenic effect on differentiated human thyroid cells and on thyroid carcinoma cells by inhibition of cell cycle progression and induction of apoptosis. Metformin inhibited growth by activation of the AMPK pathway, antagonized the growth stimulatory effect of insulin by inhibition of MAP kinase pathway and inhibited clonal cell growth and thyroid cancer sphere formation, a hallmark of cancer stem cells. Furthermore, metformin amplified the anti-mitogenic effect of chemotherapeutic agents as doxorubicin and cisplatin on undifferentiated thyroid carcinoma cells. Remarkably, this anti-proliferative effect was also observed in doxorubicin-resistant thyroid carcinoma cell line. The growth-inhibitory effect of metformin was, however, not restricted to undifferentiated thyroid carcinoma cells but was also demonstrated in thyroid carcinoma stem cells. In conclusion, metformin markedly diminished growth stimulation by insulin and showed a cumulative anti-mitogenic effect to chemotherapeutics agents. Therefore, our results suggest this drug as adjuvant treatment for undifferentiated thyroid cancer in type 2 diabetic patients and obese patients with hyperinsulinemia.

Die Hyperinsulinämie, die als Folge einer Insulinresistenz auftritt, ist ein wesentlicher pathogenetischer Faktor für die höhere Prävalenz verschiedener Tumorentitäten bei Patienten mit Typ 2 Diabetes und/oder einer Adipositas. Insulin stimuliert das Zellwachstum durch Aktivierung der Insulinrezeptor- und der IGF-Rezeptor- abhängigen Signalwege. Metformin, ein orales Antidiabetikum, hemmt diesen Wachstums-stimulierenden Effekt durch Reduktion der Hyperinsulinämie und durch einen direkten zellulären Mechanismus. Diese duale Wirkung von Metformin stellt die Rationale dar, Metformin als ein potentielles Medikament für eine adjuvante Tumortherapie zu postulieren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es: 1\. zu analysieren, ob Metformin einen anti- mitogenen Effekt auf differenzierte humane Schilddrüsenzellen und Schilddrüsenkarzinomzellen hat, und die dieser Wirkung zugrunde liegenden molekularen Mechanismen auf der zellulären Ebene aufzuklären. 2\. zu untersuchen, ob Metformin Karzinom-Stammzellen in einer Doxorubicin- resistenten anaplastischen Schilddrüsenkarzinomlinie, die angereichert mit Karzinomstammzellen ist, in ihrem Wachstum beeinflusst. 3\. die Wirkung von Metformin auf das Insulin-vermittelte Zellwachstum zu analysieren und speziell zu differenzieren, inwieweit die Wachstumshemmung über eine Aktivierung des AMPK-Signalweges und/oder eine Antagonisierung der wachstumsstimulierenden Wirkung von Insulin durch eine Hemmung des MAP-Kinase-Signalweges erfolgt. 4\. zu untersuchen, ob Metformin den anti-mitogenen Effekt von Chemotherapeutika, wie Doxorubicin und Cisplatin, auf undifferenzierte Schilddrüsenkarzinomzellen verstärken kann. Die Studie wurde durchgeführt an differenzierten menschlichen Schilddrüsenzellen, anaplastischen Schilddrüsenkarzinomzellen, einer Doxorubicin-resistenten Schilddrüsenkarzinomzelllinie und an Schilddrüsenkarzinom-Stammzellen. Der Anti-mitogene Effekt von Metformin auf differenzierte Schilddrüsenzellen, isoliert aus menschlichen Strumen, und auf Schilddrüsenkarzinomzelllinien wurde durch Zellwachstums-Analysen, Untersuchungen des Zellzyklus und der Apoptose analysiert. Ferner wurde der Einfluss einer Vorbehandlung der Zellen mit Insulin oder mit Chemotherapeutika auf die Metformin-induzierte Wachstumshemmung in Schilddrüsenkarzinomzelllinien in einer Doxorubicin-resistenten Schilddrüsenkarzinomzelllinie und davon abgeleiteten Karzinomstammzellen untersucht. In der Arbeit wurde gezeigt, dass Metformin anti-mitogen auf differenzierte menschliche Schilddrüsenzellen und Schilddrüsenkarzinomzelllinien wirkt, indem es die Zellzyklusprogression hemmt und eine Apoptose induziert. Metformin hemmte das Zellwachstum durch Aktivierung des AMPK-Signalweges, antagonisierte die Wachstumsstimulation von Insulin durch Hemmung des MAP-Kinase-Signalweges und hemmte ferner das klonale Wachstum und bei Schilddrüsenkarzinomzellen die so gen. Bildung von „spheres“, ein Charakteristikum von Karzinomstammzellen. Ferner verstärkte Metformin den anti-mitogenen Effekt von Chemotherapeutika wie Doxorubicin und Cisplatin auf undifferenzierte Schilddrüsenkarzinomzellen. Interessanterweise wurde dieser antiproliferative Effekt auch in einer Doxorubicin-resistenten Schilddrüsenkarzinomzelllinie beobachtet. Der Wachstums-hemmende Effekt war nicht beschränkt auf undifferenzierte Schilddrüsenkarzinomzellen sondern auch in Schilddrüsenkarzinomstammzellen nachweisbar. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit nachgewiesen, dass Metformin die Wachstumsstimulation durch Insulin signifikant hemmt und in der Behandlung undifferenzierter Schilddrüsenkarzinomzellen bei gleichzeitiger Gabe von Chemotherapeutika einen additiven anti-mitogenen Effekt aufweist. Diese Ergebnisse sprechen dafür, Metformin zur adjuvanten Therapie undifferenzierter Schilddrüsenkarzinome bei Typ 2 Diabetikern und ggf. auch bei adipösen Patienten mit Hyperinsulinämie einzusetzen.