Structural investigation of CA150.WW2 amyloid fibrils by MAS NMR spectroscopy

Abstract

Amyloid fibrils are the major protein components of deposits found in patients suffering from amyloid diseases such as Alzheimer's or Parkinson's disease. The role of the amyloid deposits in these disorders is under debate, ranging from suggestions that they are merely byproducts that occur during the course of the disease to the hypothesis that they are the main toxic species. To improve understanding of the function of amyloid deposits in disease, it is necessary to study their interaction with cellular compounds at a molecular level. Thus, high resolution structural information on these systems is needed. Amyloid fibrils are generally non-crystalline and insoluble which largely hinders studies by X-ray crystallography and solution NMR, both being well established techniques in structural biology. Solid state NMR spectroscopy is in principle well suited to study fibrillar aggregates at atomic resolution. However, so far no routine procedure for structure determination of immobile proteins by solid state NMR spectroscopy has been established. Therefore, the total number of amyloid systems studied at atomic resolution so far is very limited and further information is necessary to develop a general understanding of amyloid structure, formation of amyloid deposits, and amyloid toxicity. In this work, the structural properties of amyloid fibrils formed by the second WW-domain of CA150, a human transcriptional activator, were studied. The system was chosen for structural investigations because a wealth of information on the fibrillation properties of CA150.WW2 and several of its variants was available from a collaboration with Neil Ferguson and Alan R. Fersht from the MRC in Cambridge, UK. A novel assignment strategy was devised. It is based on the amino acid labelling pattern introduced by using 1,3-13C-glycerol or 2-13C-glycerol as the only carbon source during recombinant protein expression. The observed labelling pattern facilitates the assignment of the signal sets to a certain type of residue. In addition, sequential cross peaks, such as Calpha/Calpha signals, are only observed when both sites are labelled which is only the case for certain residue combinations in the glycerol-labelled samples. This reduces the spectral overlap as well as the number of assignment possibilities. Interestingly, deuteration led to spectra with significantly reduced line width. From 13C-13C and 13C-15N experiments recorded with long mixing times, 29 distance constaints were extracted. Additonal structural constraints were obtained by TALOS dihedral angle prediction, electron microscopy, and alanine scanning. The data was combined to derive a structural model of the monomeric unit in CA150.WW2 amyloid fibrils. It consists of two long beta-strands connected by a short loop. The two beta-strands are incorporated into two different beta-sheets which interact with each other via their side chains. Direct excitation solid state NMR spectra showed that the C-terminal residues exhibit increased mobility. The overall fibril architecture was determined using amyloid fibrils grown from mixtures of specially labelled peptides. This enabled analysis of the general arrangement of the two beta-strands in the amyloid fibrils. Structures were calculated for three slightly different geometries. In all cases, they consist of parallel beta-sheets which interact via their side chains comparable to the steric zipper motif observed by X-ray crystallography on fibril-like crystals of short peptides. The determined structures of CA150.WW2 and other amyloid fibrils which are described in the literature (Abeta, K3-peptide, and HET-s amyloid fibrils) all contain two or three beta-sheets that interact with each other in a manner similar to the two and three-stranded parallel beta-helices. Thus, this work supports the assumption that there is a general amyloid folding motif which resembles the beta-helical structures.

Amyloidfibrillen sind die Hauptbestandteile der Ablagerungen, die im Verlauf von Amyloiderkrankungen wie z.B. der Alzheimer- oder der Parkinson-Krankheit entstehen. Die Rolle, die diese Ablagerungen im jeweiligen Krankheitsverlauf spielen, wird kontrovers diskutiert. Die Vorschläge reichen dabei von der Annahme, dass es sich bei den Ablagerungen um Nebenprodukte anderer schädlicher Prozesse handelt zur Hypothese, dass sie ursächlich für das Auftreten von Symptomen wie dem Absterben von Zellen sind. Um die Bedeutung der Amyloidablagerungen besser zu verstehen, ist es notwendig ihre Wechselwirkung mit anderen Zellbestandteilen auf molekularer Ebene zu untersuchen. Dies erfordert die Kenntnis der dreidimensionalen Fibrillenstruktur in hoher Auflösung. In der Regel sind die Fibrillen jedoch unlöslich und nicht kristallin, so dass die etablierten strukturbiologischen Methoden der Röntgenkristallographie und der Lösungs-NMR-Spektroskopie nur von sehr begrenztem Nutzen sind. Die Festkörper-NMR-Spektroskopie ist dagegen prinzipiell sehr gut geeignet, um Strukturdaten mit atomarer Auflösung an fibrillären Aggregaten zu gewinnen. Bisher wurde aber noch keine allgemeingültige Methode zur Strukturbestimmung von immobilisierten Proteinen mit der Festkörper-NMR-Spektroskopie etabliert, so dass nur von einer geringen Anzahl von Amyloidsystemen hochaufgelöste Strukturinformationen vorliegen. Für das allgemeine Verständnis von Amyloidstrukturen, der Ausbildung von Amyloidablagerungen und ihrer Zelltoxizität ist es deshalb notwendig, Strukturuntersuchungen an einer größeren Anzahl von Amyloidsystemen durchzuführen. In dieser Arbeit wurden die strukturellen Eigenschaften von Amyloidfibrillen, die von der zweiten WW-Domäne des humanen Transkriptionsaktivators CA150 gebildet werden, untersucht. Dieses System wurde für die Strukturuntersuchungen ausgewählt, da aufgrund einer Kooperation mit Neil Ferguson und Alan R. Fersht vom MRC in Cambridge in Großbritannien im großen Umfang Daten zu den Fibrillierungseigenschaften von CA150.WW2 und vielen Mutanten zur Verfügung standen. Es wurde eine neuartige Zuordnungsstrategie entwickelt. Diese basiert auf dem Markierungsmuster, das bei der rekombinanten Proteinsynthese entsteht, wenn 1,3-13C- oder 2-13C- Glycerol als einzige Kohlenstoffquelle zur Verfügung stehen. Diese Markierungsmuster erleichtern die Zuordnung einzelner Signalsätze zu einem bestimmten Aminosäurerest. Außerdem werden sequenzielle Kreuzsignale, wie z.B. Calpha/Calpha-Kontakte, nur beobachtet, wenn beide Aminosäuren markiert sind. Für die Glycerol-markierten Proben trifft dies nur für bestimmte sequenzielle Paare zu, so dass sich die Signalüberlagerung reduziert, und 13C-13C- Korrelationen für die Zuordnung genutzt werden können. Interessanterweise führte Deuterierung zu Spektren mit schmaleren Linien. Die sequentielle Zuordnung der NMR-Signale der CA150.WW2 Amyloidfibrillen ermöglichte die Bestimmung von 29 Abstandsbedingungen aus 13C-13C- und 13C-15N-Spektren mit langer Mischzeit. Zusätzliche Strukturdaten wurden mittels TALOS- Diederwinkelvorhersage, Elektronenmikroskopie und Alaninmutagenese bestimmt. Ausgehend von diesen Daten wurde ein Strukturmodell der monomeren Einheit in CA150.WW2 Amyloidfibrillen erstellt. Es besteht aus zwei langen beta-Strängen, die über eine kurze Schleife verbunden sind. Die einzelnen beta-Stränge sind Teil von zwei unterschiedlichen beta-Faltblättern, die über ihre Seitenketten miteinander in Kontakt stehen. NMR Spektren mit direkter Anregung zeigten, dass das C-terminale Ende der monomeren Einheit eine erhöhte Mobilität aufweist. Die Gesamtarchitektur der Amyloidfibrillen wurde mithilfe von Proben aus Mischungen unterschiedlich markierter Peptide bestimmt. Dabei wurde die Anordnung der einzelnen beta-Stränge und die gegenseitige Verschiebung der beiden beta-Faltblätter entlang der Fibrillenhauptachse untersucht. Für drei leicht unterschiedliche Anordnungen wurden Strukturrechnungen durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Interaktionsfläche zwischen den beiden beta-Faltblättern in allen drei Strukturen sehr ähnlich war, so dass nicht unterschieden werden konnte, welche dieser Möglichkeiten der wirklichen Amyloidfibrillenstruktur am nächsten kommt. In allen Strukturen erfolgte die Wechselwirkung zwischen den beta-Faltblättern durch eine Verzahnung der Seitenketten, welche dem sogenannten sterischen Reißverschluss, der in Röntgenstrukturanalysen an fibrillenartigen Kristallen von kleinen Peptiden gefunden wurde, ähnelt. Die Strukturen von CA150.WW2 sowie von anderen aus der Literatur bekanneten Amyloidfibrillen (Abeta, K3-Peptid und HET-s) enthalten jeweils zwei oder drei beta-Faltblätter, die miteinander auf eine Art und Weise in Wechselwirkung stehen, die den zwei- bzw. dreisträngigen parallelen beta-Helizes ähnelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit unterstützen daher die Annahme, dass es ein allgemeines Faltungsmotiv für Amyloidfibrillen gibt, welches als beta-helikal beschrieben werden kann.