Population genetic study for evaluating the differentiation and gene flow among Eastern Mediterranean strains of the Leishmania donovani complex

Abstract

The present study aimed to assess the population genetic structure of L. donovani complex strains from eastern Mediterranean focusing on southeastern (SE) Europe, where leishmaniasis represents a major public health problem. L. infantum zymodeme MON-1 is the main causative agent of human (HVL) and canine visceral leishmaniasis (CanL), and occasionally of human cutaneous leishmaniasis (HCL) in this area. The evident re-emergence of cases in classical endemic foci and reports of imported or autochthonous cases in formerly non-endemic regions calls for new epidemiological studies using highly discriminating markers. Leishmania strains were isolated from HVL, CanL and HCL cases in six countries ranging from Croatia to Turkey, and from Phlebotomus tobbi sand flies in Turkey. These strains were initially typed by the K26-PCR assay, which amplifies the HASPB region, and multilocus enzyme electrophoresis (MLEE). Both methods corroborated the predominance of L. infantum MON-1 in SE Europe. MLEE exposed also a considerable number of zymodeme MON-98 strains in Turkey and Greece. All human isolates from Cyprus were identified as L. donovani sensu stricto MON-37. The Turkish strains from Cukurova and one HVL isolate from Kusadasi represented two novel zymodemes, MON-308 and MON-309. Multilocus microsatellite typing (MLMT) was performed to exploit genetic diversity and population structure of the SE L. donovani complex strains. It assigned the SE and southwestern (SW) European strains to clearly distinct genetic populations. Croatian strains were divided in-between reflecting the geographic position of this country. All Cypriot canine isolates constituted a monophyletic group suggesting the circulation of a homogenous MON-1 population among dogs. MLMT did not support the differentiation between MON-1 and MON-98 zymodemes. Strains of these zymodemes from Turkey, Bulgaria, Greece and Albania grouped together in different highly heterogeneous populations. Our data point to recombination events and substantial gene flow among them. MLMT showed that strains of zymodeme MON-37 are paraphyletic. The Cypriot MON-37 strains formed a unique genetic group and were clearly distinct from MON-37 strains from the Indian subcontinent, Middle East and East Africa. Thus, the Cypriot MON-37 strains could possibly be autochthonous. When the Turkish MON-308 and MON-309 strains and the Cypriot MON-37 were compared to other L. donovani complex strains, the Turkish and Cypriot strains formed a new monophyletic group, clearly distinct from all other previously identified groups. Our observations suggest the existence of hybrids, aneuploidies or mixed infections for these Cypriot and Turkish strains thus raising concerns about their spreading to neighboring Mediterranean countries.

Das Ziel der vorliegenden Studie war eine populationsgenetische Untersuchung des L. donovani-Komplexes mit dem Fokus auf Südost-Europa (SO), wo Leishmaniosen ein wichtiges Gesundheitsproblem darstellen. L. infantum-Stämme des Zymodems MON-1 sind die häufigsten Erreger humaner (HVL) und caniner (CanL) viszeraler Leishmaniosen, verursachen aber auch gelegentlich humane kutane Leishmaniosen (HCL) in diesem Gebiet. Das Wiederaufleben der Erkrankungen in klassischen Endemiegebieten und Berichte über importierte oder autochthone Erkrankungen in früher nicht-endemischen Gebieten erfordern neue epidemiologische Studien und die Anwendung hoch-diskriminierender Marker. In dieser Studie wurden Leishmania-Stämme untersucht, die von HVL-, CanL- und HCL-Fällen in 6 Ländern, von Kroatien bis zur Türkei, und von Phlebotomus tobbi Sandmücken in der Türkei isoliert wurden. Die Stämme wurden zunächst mit der K26-PCR, die den HASPB-Lokus amplifiziert, und der Multilokus-Enzym- Eelektrophorese (MLEE) typisiert. Beide Methoden haben die Prädominanz von L. infantum MON-1 in SO bestätigt. Die MLEE hat auch eine große Anzahl von Zymodem MON-98 Stämmen in Griechenland und der Türkei nachgewiesen. Alle zypriotischen humanen Isolate wurden als L. donovani sensu stricto MON-37 identifiziert. Die türkischen Stämme aus Cukurova und ein HVL-Isolat aus Kusadasi repräsentieren zwei neue Zymodeme, MON-308 und -309. Die genetische Diversität und die Populationsstruktur der SO-Stämme des L. donovani-Komplexes wurde mittels Multilokus-Mikrosatelliten-Typisierung (MLMT) untersucht, welche die Stämme aus SO und Südwest-Europa (SW) genetisch unterschiedlichen Populationen zuordnete. Kroatische Stämme waren in beiden Populationen zu finden, in Übereinstimmung mit der geografischen Lage dieses Landes. Alle Hundeisolate aus Zypern bildeten eine monophyletische Gruppe, was auf die Zirkulation einer homogenen MON-1-Population unter diesen Hunden schließen lässt. Die MLMT konnte keine Unterschiede zwischen MON-1- und MON-98-Stämmen feststellen. Stämme beider Zymodeme aus der Türkei, Bulgarien, Griechenland und Albanien wurden verschiedenen sehr heterogenen Populationen zugeordnet, mit deutlichen Hinweisen auf Rekombinationen und Genfluss zwischen ihnen. Mittels MLMT wurde gezeigt, dass die MON-37-Stämme paraphyletisch sind. Die zypriotischen Stämme bildeten eine eigenständige genetische Gruppe, unterschieden sich klar von den MON-37-Stämmen vom indischen Subkontinent, vom Mittleren Osten und Ostafrika und könnten autochthonen Ursprungs sein. Der Vergleich der türkischen MON-308- und MON-309-Stämme sowie der zypriotischen MON-37-Stämme mit Stämmen anderer Herkunft ergab, dass diese türkischen und zypriotischen Stämme zu einer neuen monophyletischen Gruppe im L. donovani- Komplex gehören, die sich klar von allen bisher nachgewiesenen Gruppen unterscheidet. Die Existenz von Hybriden, Aneuploidie und Mischinfektionen in dieser Gruppe ist wahrscheinlich und ihre weitere Ausbreitung in benachbarten Ländern zu befürchten.