Molecular mechanisms of thrombin-induced early and late-phase of ERK1/2 phosphorylation in vascular smooth muscle cells

Abstract

Vascular smooth muscle (VSM) cells are highly specialized cells whose primary function is the contraction of blood vessels and the regulation of vascular tone. Differentiated VSM cells exhibit a low rate of proliferation and a low synthetic activity. Under pathological conditions, VSM cells change from the normal differentiated state to a proliferative, synthetic phenotype. Pathologically altered VSM cells contribute to the progression of vascular diseases. The ERK/MAPK signaling pathway is involved in the phenotypic modulation of several cell types. Various studies have demonstrated that a thrombin-induced redifferentation of VSM cells require a biphasic activation of ERK1/2 via EGFR transactivation. However, the mechanisms of the cessation and delayed reappearance of the ERK1/2 phosphorylation remain elusive. The findings presented here demonstrate the necessity of {\it de novo\/} RNA and protein synthesis for the long-lasting ERK1/2 activation. Inhibition of the second phase of the ERK1/2 phosphorylation by cytochalasin D, or brefeldin A treatment, indicated that the transport of plasma membrane-resident or of secretory proteins may play a critical role in this signalling cascade. Analysis of the thrombin-induced transcription and expression rates of plasma membrane-resident proteins revealed an upregulation of heparin-binding EGF- like growth factor (HB-EGF) with a temporal pattern that closely matches the second phase of ERK1/2 activation. Using confocal laser scanning microscopy, it could be demonstrated that HB-EGF is rapidly processed and transported to the plasma membrane. This result was supported by HB-EGF immunoblot analysis in VSM cell membrane fractions. Inhibition of both phases of ERK1/2 activation by MMP inactivation and blocking of the EGFR autophosphorylation demonstrated the requirement of the extracellular shedding and receptor tyrosine kinase activation for the PAR1-induced ERK1/2 phosphorylation. Pharmacological and RNA interference-mediated modulation of HB-EGF expression abolished the late phase of ERK1/2 phosphorylation, demonstrating that {\it de novo\/} HB-EGF expression and HB-EGF-induced EGFR transactivation are necessary intermediates in the thrombin-induced long-lasting ERK1/2 activation in VSM cells. Future investigations should elucidate the implication of HB-EGF in the redifferentiation of other cell types. Although it is suggested, that Src and Pyk2 contribute to the thrombin-induced ERK1/2 activation, there is a controversy over the role of both proteins in the GPCR-induced ERK1/2 phosphorylation. The results of this work demonstrated that, upon thrombin stimulation, the long-lasting ERK1/2 activation requires Src activation. Moreover, reduction of the first phase of ERK1/2 phosphorylation by MMP inactivation, HB-EGF-scavenging, or blocking of the EGFR autophosphorylation indicated that Src and Pyk2 are downstream effectors of the transactivated EGFR. Surprisingly, analysis of EGFR phosphorylation sites in response to thrombin showed that the Tyr845 of the EGFR was not phosphorylated by Src after EGFR transactivation. Finally, the critical role of Pyk2 in the EGFR- induced Src activation in VSM cells was demonstrated by siRNA-mediated Pyk2 knockdown. Further work will be necessary to elucidate the particular role of Src and Pyk2 in the thrombin-induced ERK1/2 activation.

VSM-Zellen sind hochspezialisierte Zellen deren Hauptfunktionen die Kontraktion von Blutgefäßen ist. Unter pathologischen Bedingungen können Gefäßzellen einen Wechsel von einem normalen differenzierten zu einem proliferierenden Zustand vollziehen. Diese Pathologisch veränderten Zellen sind in der Entwicklung kardiovaskulärer Krankheiten beteiligt. Der ERK/MAPK Signalweg ist an der phänotypischen Modulation von verschiedenen Zelltypen beteiligt. Eine Thrombin-induzierte "Re-differenzierung" von VSM-Zellen erfordert eine zweiphasige Aktivierung von ERK1/2. Jedoch ist der Mechanismus des Beginns und des Wiedererscheinens des Differenzierungs-Signalwegs unklar. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse zeigen die Notwendigkeit einer {\it de novo\/} RNA- und Protein-Synthese von HB-EGF für die lang anhaltende Aktivierung von ERK1/2. Eine Inhibierung der zweite Phase einer ERK1/2 Phosphorylierung durch Cytochalasin D oder Brefeldin A Behandlung, weisen daraufhin, dass der Sekretionsprotein-Transport oder der Transport an der Plasmamembran-lokalisierter Proteine eine entscheidende Rolle in der Thrombin- induzierten Signalkaskade spielen. Es konnte gezeigt werden, dass die Stimulation glatter Gefäßmuskelzellen mit Thrombin zu einer erhöhten Transkription und Proteinexpression von HB-EGF führt, die mit der zweiten Phase der ERK1/2 Aktivierung korrelieren. Mittels konfokaler Laser Scanning Mikroskopie wurde ermittelt, dass HB-EGF rasch prozessiert und zu Plasmamembran transportiert wird. Dieses Ergebnis konnte durch eine Immunoblot Analyse von HB-EGF aus VSM-Zell-membranen unterstützt werden. Die Inhibierung beider ERK1/2 Phasen durch MMP-Inaktivierung, und die Blockade der EGFR Autophosphorylierung zeigen, dass die PAR1-induzierte EGFR Transaktivierung den "triple membrane-spanning" Signalweg erfordert. Nach pharmakologischer Modulation von HB-EGF und den Einsatz von HB-EGF-siRNA, konnte gezeigt werden, dass die späte Phase der ERK1/2 Phosphorylierung verhindert wurde und dass die {\it de novo\/} Expression von HB-EGF und dessen induzierte EGFR Transaktivierung notwendige Schritte bei der Thrombin-induzierten Redifferenzierung von VSM-Zellen sind. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um den Einfluss von HB-EGF auf die Redifferenzierng anderer Zellen zu verstehen. Obwohl angenommen wird, dass Src und Pyk2 zur ERK1/2 Phosphorylierung beitragen, so sind die Meinungen über ihre Rolle in der GPCR- vermittelten Thrombin-abhängigen ERK1/2 Aktivierung verschieden. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass eine Stimulation glatter VSM-Zellen mit Thrombin, eine Src Aktivierung benötigt, um ERK1/2 zu phosphorylieren. Da sowohl die Inhibition der MMP Aktivität, als auch die Bindung von HB-EGF durch Heparin oder durch Blockade der EGFR Autophosphorylierung die zweite Phase der ERK1/2 Aktivierung drastisch reduzieren, konnte gezeigt werden, dass Pyk2 und Src nachgeschaltete Effektoren der Transaktivierung des EGFR sind. Untersuchungen der EGFR Phosphorylierung nach Stimulation von glatten Muskelzellen mit Thrombin zeigte, dass das Tyr845 des EGFR nicht durch Src phosphoryliert wird. Schließlich konnte durch Pyk2 Knockout mittels siRNA gezeigt werden, dass Pyk2 ein Zwischenprodukt der EGFR-induzierten Src Aktivierung in VSM-Zellen ist. Untersuchungen müssen vorgenommen werden, um die genaue Rolle von Src und Pyk2 in der Thrombin-induzierten Phosphorylierung von ERK1/2 zu verstehen.