Funktionelle Charakterisierung des Toleranz-assoziierten Gens TOAG-1

Abstract

Die gezielte Beeinflussung des Immunsystems steht derzeit im Fokus der Forschung bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Tumoren oder der Vermeidung von Transplantatabstoßungen. Da Patienten auf die Modulation der Immunantwort individuell ansprechen, sind Biomarker, welche den Therapieerfolg frühzeitig anzeigen von größtem Interesse. Frühere Studien konnten anhand der Genexpression des Toleranz-assoziierte Gens 1 (TOAG-1), bevorstehende Abstoßungsreaktionen nach allogenen Organtransplantationen im Nager-Modell frühzeitig anzeigen. Die funktionelle Charakterisierung dieses weitgehend unbekannten Gens TOAG-1 in T-Zellen stand im Fokus dieser Arbeit. Es konnte gezeigt werden, dass TOAG-1 ein kernkodiertes aber mitochondrial lokalisiertes Protein ist, dessen mRNS-Expression in T-Zellen nach allogener Stimulation transient vermindert wird. TOAG-1 überexprimierende murine T-Zellen zeigten verringertes mitochondriales Membranpotential und verstärkte Apoptoseneigung. Darüber hinaus wurden inflammatorische Zytokine wie z. B. IFNγ verringert sezerniert, im Vergleich zur Transduktion mit dem Kontrollvirus. Daher könnte TOAG-1 an der Modulation der T-Zellaktivierung beteiligt sein und als potentieller Biomarker immunmodulatorischer Therapien dienen. Die in vitro Behandlung mit dem Biologikum Alefacept hemmte die Proliferation von humanen PBMCs und verhinderte den Verlust der TOAG-1-mRNS-Expression sowohl in naiven und memory CD4+ T-Zellen, als auch in CD8+ T-Zellen. Auch der, nach allogener Stimulation beobachtete, Anstieg der RHAMM (Rezeptor für Hyaluronan- vermittelte Migration) Transkription wurde durch die Alefacept-Behandlung in vitro verhindert. Weiterhin führte Alefacept, ähnlich wie die Überexpression von TOAG-1, zur Reduktion des mitochondrialen Membranpotentials und zur verstärkten Apoptoseneigung in den drei untersuchten T-Zellsubpopulationen. Die Oberflächenexpression des negativ regulierenden PD-L1 wurde sowohl auf CD4+ T-Zellen als auch auf antigenpräsentierenden Zellen nach Alefacept- Behandlung induziert. Diese reduzierte Proliferation war abhängig von einer gesteigerten PD-L1 Oberflächenexpression auf antigenpräsentierenden Zellen in der Kultur. Zum Abschluss wurde das diagnostische Potenzial der Analyse der TOAG-1 Transkription in einer Alefacept-Studie in Psoriasis-Patienten getestet. Hierzu wurden 20 Patienten über einen Zeitraum von 12 Wochen mit 15 mg Alefacept wöchentlich behandelt. Die Therapie war in 9 von 20 Patienten erfolgreich (PASI-Reduktion ≥ 50 %) Alle Patienten wiesen nach Therapie einen Verlust von CD4+ und CD8+ memory T-Zellen auf. Wobei der Verlust von CD8+ T-Zellen in erfolgreich therapierten Patienten ausgeprägter, wenn auch nicht signifikant, war. Eine Unterscheidung der Patienten mit und ohne genügenden Therapieerfolg war anhand des PASI erst in Woche 9 möglich. Wohingegen die mRNS-Expression von TOAG-1 bereits in Woche 2 der Therapie signifikant unterschiedlich zwischen beiden Patientengruppen reguliert war. Auch die RHAMM Transkription zeigte schon in Woche 3 signifikante Unterschiede. Die Kombination beider Marker in Form einer Ratio verstärkte das Unterscheidungspotential über den gesamten Therapieverlauf.

Immune modulating therapies gain increasing importance in treatment of autoimmune diseases, tumors or prevention of transplant-rejection. However, none of the currently applied biologics achieves significant clinical improvement in all treated patients. Since the therapy with biologics is cost intensive and sometimes associated with side effects, non-invasive diagnostic tools for early prediction of responders are of major interest. The tolerance associated gene 1 (TOAG-1) has been described to be highly expressed in graft infiltrating cells and whole blood of tolerance developing recipients in an allogeneic rat kidney transplantation model. So far the subcellular localization of TOAG-1 and its function is unknown. Here we show TOAG-1 protein to be located in mitochondria and its mRNA expression dramatically decreased after T cell activation in vitro. Furthermore over expression of TOAG-1 in murine primary CD4+ T cells led to a loss of mitochondrial membrane potential, a higher susceptibility to apoptosis and decreased cytokine release (e.g. IFNγ). These findings suggest a possible role of TOAG-1 during T cell activation and it therefore might serve as a biomarker of immune modulatory therapies. Furthermore we studied the effects of Alefacept (LFA3Ig), an approved “biologic” for treatment of psoriasis, on leukocytes in vitro and in vivo to identify gene markers (TOAG-1, RHAMM) predictive for treatment response. Addition of Alefacept to cultures of human CD8+, naïve or memory CD4+ T cells stimulated in vitro, resulted in increased TOAG-1 and reduced RHAMM mRNA expression accompanied by reduced proliferation, loss of mitochondrial membrane potential and apoptosis induction. This effect was dependent on enhanced PD-L1 expression by antigen presenting cells present in the culture. In an open-label study 20 psoriasis patients were treated weekly with 15 mg Alefacept over 12 weeks. Therapy was successful in 9 of 20 patients (PASI reduction ≥ 50 %). Memory CD4+ as well as memory CD8+ T cells were reduced in all patients at the end of therapy. However, reduction of CD8+ memory T cells was more pronounced in responding patients though not significantly different between both groups. Discrimination of both groups based on PASI reduction was possible not until week 9 after therapy onset. In contrast peripheral transcription of TOAG-1 was significantly up-regulated whereas RHAMM transcription was down-regulated in PBMCs of responding patients prior to clinical improvement (week 2 to 4). Our results indicate that peripheral changes of TOAG-1 and RHAMM expression can be used to predict clinical response to Alefacept treatment in psoriasis patients as early as 2 weeks after therapy onset. Combination of both genes via calculating a ratio could further improve discriminatory power throughout Alefacept therapy.