Effekte von Deletionen des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels im Zusammenhang mit chronologischem Altern und der intrazellulären Aminosäureverteilung

Abstract

Der erste Teil der Dissertation befasste sich mit der Analyse zweier Gene, welche sich in einem kompetitiven Haploprofizienzscreen zur chronologischen Alterung angereichert haben. Die Studien an VHR1 und NQM1 haben gezeigt, dass sich die Interaktion der beiden Gene in einem Haploprofizienzphänotyp in sowohl kompetitiven als auch nicht-kompetitiven chronologischen Alterungsexperimenten ausprägt, welcher sich als erhöhte Klonogenizität während der stationären Phase manifestiert. Es konnte nachgewiesen werden dass NQM1 ein durch Glucose reprimiertes Gen darstellt, dessen Funktion vermehrt unter gluconeogenetischen Bedingungen anzusiedeln ist. NQM1 stellt zudem eine, durch diverse Stressarten induzierte, Isoform von TAL1 dar, wird aber unabhängig von dieser reguliert und erfüllt daher höchstwahrscheinlich eine abweichende biochemische Funktion. Die Expression von NQM1 wird in Abhängigkeit der zugrundeliegenden Stressquelle durch den Transkriptionsfaktor VHR1 reguliert (Kalorierestriktion, osmotischer Stress) und ist dabei in ihrer Ausprägung von der Präsenz des VHR1 \- Transkriptionsfaktors abhängig. Der detaillierte molekulare Mechanismus über den NQM1 in den Metabolismus unter stationären Bedingungen involviert ist und inwiefern VHR1 generell an der Langzeitadaptation bzw. der Langzeitregulation von NQM1 beteiligt ist, muss in zukünftigen Studien weiter aufgeklärt werden. Dennoch zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse deutlich, dass NQM1 den zentralen Kohlenhydratstoffwechsel beeinflusst und zusätzlich in die, für den Alterungsprozess charakteristischen Facetten wie bspw. der Abwehr von oxidativen und osmotischen Stress, sowie Kalorierestriktion involviert ist. Im zweiten Teil der Dissertation wurden die Effekte von kombinierten genetischen und umweltbedingten Perturbation (alternative Kohlenstoffquellen Glucose, Galactose, Ethanol) der zentralen Kohlenhydratstoffwechselwege Glycolyse und Pentosephosphatweg auf die Verteilung der intrazellulären Aminosäuren hin untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass sich die Aminosäureverteilungsprofile innerhalb der Gruppe von entweder Glycolyse bzw. Pentosephosphatwegmutanten unter dem Einfluss von Glucose und Galactose ähnlicher sind als unter Ethanol, wo die Konzentrationsverhältnisse zumeist im Trend invertiert waren. Der Einfluss der Kohlenstoffquellen dominierte dabei über die genetischen Deletionen, sodass deutlich separierte Muster in den Aminosäureverteilungsprofilen zwischen Glucose, Galactose und Ethanol identifiziert werden konnten. Allgemein offenbarte sich eine Konstanz des intrazellulären Aminosäurepools hinsichtlich genetischer Perturbationen der Stoffwechselwege Glycolyse- und PPP, da die Konzentrationen in den Deletionsmutanten maximal um das Vierfache zum Wildtyp verändert waren. Deletionen in zentralen Positionen, an denen Metaboliten generiert werden, welche zur Synthese von Aminosäuren notwendig sind, zeigten unter Glucose stark veränderte Aminosäurelevel. Gleiches galt für spezifische Enzyme des Gluconeogenese unter nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen (Ethanol). Die beobachteten Veränderungen in den Mutanten waren häufig spezifisch für eine Kohlenstoffquelle. Konstante Veränderungen in spezifischen Aminosäuren unter Glucose, Galactose, Ethanol wurden nur bei den Mutanten Δpyc2, Δfbp1, Δprs5, Δtal1 festgestellt. Des Weiteren konnten für die Aminosäuren korrelative Beziehungen und deren Konstanz unter den Kohlenstoffquellen demonstriert werden. Für die Glycolysemutanten bestand dabei die höchste Korrelation zwischen den Aminosäuregruppen Threonin, Aspartat, Glycin sowie zwischen Serin, Glutamin und Alanin, Isoleucin, Valin, Tryptophan. Für die Pentosephosphatwegmutanten zeigte sich die korrelative Konstanz vor allem für Lysin, Arginin, Glutamin und Serin, Threonin sowie zwischen Valin, Isoleucin, Tryptophan, Tyrosin, Phenylalanin. Analysen zur individuellen Konzentration der jeweiligen Aminosäuren unter Glucose, Galactose, Ethanol ergaben zudem für beide Sets an Mutanten, vor allem für Lysin, Threonin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin die höchste Konstanz und für Leucin die höchste Variabilität der Konzentrationen unter allen untersuchten Kohlenstoffquellen.

The first part of the thesis was focused on the analyses of two genes that were enriched in a competitive haploproficiency screen related to chronological aging in yeast. Studying the function of VHR1 and NQM1 led to the observation that the interaction of both genes manifested in a haploproficient phenotype of enhanced clonogenicity upon stationary phase in both competitive and non-competitive chronological aging experiments. It was shown, that NQM1 reflects a glucose repressed gene which functions primarily under gluconeogenic conditions. Moreover, NQM1 represents a stress inducible isoform of the transaldolase TAL1, but is regulated independently of TAL1 and thus possibly fulfills an alternative biochemical function. The expression of NQM1 is dependent on the applied stress and thereby regulated by the transcription factor VHR1 (e.g. under conditions of osmotic stress and caloric restriction) which also affects the magnitude of the NQM1 expression. The detailed molecular mechanism in which NQM1 is implicated in the metabolism of the late stationary phase and how the interaction of VHR1 and NQM1 is necessary for long-time adaption or long-time regulation needs to be elucidated in future studies. However, the data presented here have shown that NQM1 affects glucose metabolic activity in yeast stationary phase, under oxidative stress, osmotic stress and caloric restriction, and is thus implicated in different facets of the aging process. The second part of the thesis was focused on the effects of how combined environmental (alternative carbon sources glucose, galactose, ethanol) and genetic perturbations of two main pathways of the central carbon metabolism (glycolysis and pentose phosphate pathway) influence the distribution of intracellular amino acids. It was demonstrated that the amino acid profiles of either glycolytic or pentose phosphate pathway-associated mutants do show more similarities when grown in glucose or galactose as in ethanol, which showed mostly inverted concentration trends. The influence of the carbon substrates dominated over genetic mutations, which was clearly shown by the distinct profile patterns. In general, the intracellular amino acid pool depicted stability against genetic perturbations of glycolysis or pentose phosphate pathway enzymes since the amino acid concentrations in-/decreased not more than 4-fold compared to wild type level. Deletions in central pathway positions whose metabolites are building blocks to amino acids showed more changes on glucose as sole carbon source. Deletions affecting gluconeogenic enzymes showed more changes on non- fermentable carbon sources (ethanol). In general, most of the concentration changes identified within the mutants were specific to one carbon source. Persisting amino acid changes among all three carbon sources were only identified for Δpyc2, Δfbp1, Δtal1, Δprs5. Correlative associations among amino acids were discovered and their stability could be confirmed among the carbon sources. For the glycolytic mutants, highest correlation was shown for threonine, aspartate, glycine as well as for serine, glutamine and the group of alanine, isoleucine, valine, tryptophan. For the pentose phosphate pathway mutants, highest correlative stability was shown for lysine, arginine, glutamine as well as for serine, threonine and the group of valine, isoleucine, tryptophan, tyrosine, phenylalanine. Analyses of the individual concentrations of a specific amino acid on glucose, galactose or ethanol resulted in the most stable concentrations for lysine, threonine, proline, phenylalanine, tryptophan, tyrosine for both mutant sets among the carbon substrates. Leucine depicted the highest variability among all carbon sources.