Gene Signatures and Functional Analysis of Follicular B Helper T cells

Abstract

T cell dependent B cell responses depend on an intricate interplay of dendritic cells, CD4 T cells and B cells within the secondary lymphoid organs. CD4 T cells essentially mediate directing cognate responses derived from dendritic cells to B cell in the form of B cell help. This enables activated B cells to differentiate into antibody producing plasma cells. Recirculating Naïve T cells get activated upon recognizing the antigen on the surface of dendritic cells and transiently upregulate chemokine receptor CXCR5. Expression of CXCR5 enables these cells to respond to CXCL13 and relocate to B cell follicles for cognate interactions with B cells. Activated CD4 T cells and B cells recognizing the same antigen interact at the border between T cell zone and B cell follicle. This results in the formation of germinal centers, which supports B cell affinity maturation, isotype switching and formation of plasma cells. CXCR5 expressing CD4 T cells in germinal centers are known as follicular B helper T (TFH) cells, which were earlier thought to represent T helper 2 (Th2) cells. Present study aims to identify the actual follicular B helper T cells by investigating their functional and molecular aspects. Approximately 60% of the CD4 T cells express CXCR5 in tonsils, which is a representative secondary lymphoid organ. These cells also express classical memory marker CD45RO and varying levels of costimulatory molecule ICOS. A subset of these cells also expresses CD57. Based on the co-expression of CXCR5 and ICOS, CD4 T cells from tonsils were subdivided into CXCR5-ICOS-/lo, CXCR5loICOSint and CXCR5hiICOShi subsets and used for downstream in vitro experiments. CXCR5loICOSint and CXCR5hiICOShi cells did not differ in chemotatic response to CXCL13. Tonsillar CD4 T cell subsets restrict expression of chemokine receptors as compared to peripheral blood subsets namely, Naïve, TCM1, TCM and TEM. Follicular B cell help is tested using cocultures of tonsillar CD4 T cell subsets and autologous B cells and assessing the immunoglobulin production in the culture supernatants by using ELISA. CXCR5hiICOShi cells were observed to be the most potent B cell stimulators. These cells also secreted highest levels of CXCL13 in cocultures. CXCR5hiICOShi cells showed reduced proliferative potential and enhanced susceptibility to apoptosis as compared to CXCR5loICOSint and CXCR5-ICOS-/lo cells, which might indicate a state of terminal differentiation. Previous reports have shown that subset expressing CD57 might be the actual subset involved in B cell help. Using the cocultures of CD57+ and CD57- subsets within CXCR5loICOSint and CXCR5hiICOShi cells, it was observed that B cell stimulation and CXCL13 secretion was independent of CD57 expression. Based on these observations we propose that CXCR5hiICOShi cells represent follicular B helper T cells. CXCR5-ICOS-/lo might represent antigen inexperienced cells and CXCR5loICOSint could be the precursors of CXCR5hiICOShi cells. To characterize tonsillar CD4 T cell subsets at molecular level and determine their relationship with peripheral blood subsets, large-scale gene expressing profiling was carried out. It was evident that CXCR5hiICOShi cells constitute a distinct subset and distantly related to other effector cells. Gene expression data from tonsillar subsets indicates that CXCR5hiICOShi cells are derived from CXCR5-ICOS-/lo cells via CXCR5loICOSint cells. In addition, gene expression data also suggests that follicular help might be a non-Th1/Th2 entity. Analysis of differential expression of genes in various functional classes indicated previously unknown genes and pathways laying foundations for future work.

T-Zell-abhängige Immunantworten resultieren aus einem komplexen, räumlich und zeitlich koordinierten Zusammenspiel von dendritischen Zellen, CD4 T-Zellen und B-Zellen in sekundären lymphatischen Organen. CD4 T-Zellen spielen dabei eine zentrale Rolle bei der Aktivierung von B-Zellen und deren Differenzierung in Antikörper-produzierende Plasmazellen. Naive, rezirkulierende CD4 T-Zellen werden zunächst durch dendritische Zellen in den T-Zell-Zonen sekundärer lymphatischer Organe aktiviert, bevor sie als T-Helfer-Zellen die Differenzierung von B-Zellen zu Plasmazellen steuern können. Die Aktivierung ist mit einer transienten Expression des Chemokinrezeptors CXCR5 verbunden, dessen Ligand spezifisch in den B-Zell-Follikeln dieser Organe produziert wird. Aktivierte, CXCR5-exprimierende CD4 T-Zellen wandern zunächst in den Grenzbereich von T-Zell-Zone und B-Zell-Follikel, um dort B-Zellen mit gleicher Antigen-Spezifität zu aktivieren. Vollständig aktivierte B-Zellen können in die B-Zell-Follikel einwandern und Keimzentren ausbilden, in denen die Affinitätsreifung und der Isotypen-Klassenwechsel der B-Zellen stattfinden. CXCR5-exprimierende CD4 T-Zellen, die in Keimzentren einwandern werden as follikuläre B-Helfer T (TFH)-Zellen bezeichnet, da sie direkten Einfluss auf die Keimzentrumsreaktion haben indem sie beispielsweise B-Zellen stimulieren, Antikörper zu produzieren, und am Wechsel der Isotypen-Klassen beteiligt sind. Ursprünglich wurde angenommen, dass diese Aufgabe durch klassische T-Helfer Zellen des Typs 2 übernommen wird, neuere Ergebnisse legen nahe, dass es sich bei TFH-Zellen um eine eigenständige Population von CD4 T-Zellen handelt. Ziel der Arbeit war eine präzise Beschreibung des Phänotyps und der funktionellen Eigenschaften follikulärer B-Helfer T-Zellen sowie eine vergleichende Analyse der Genexpression von CD4 T-Zell-Populationen zur Identifizierung von Genen, die für die Funktion und Differenzierung von TFH- Zellen von besonderer Bedeutung sind. Etwa 60 % der tonsillären CD4 T-Zellen exprimieren den Chemokinrezeptor CXCR5. Die überwiegende Zahl dieser Zellen exprimiert zudem den Memory-Marker CD45RO, unterschiedliche Level des kostimulatorischen Moleküls ICOS und eine Subpopulation zudem das CD57 Antigen. Basierend auf dem charakteristischen Expressionsmuster von CXCR5 und ICOS wurden drei Populationen tonsillärer CD4 T-Zellen (CXCR5-ICOS-/lo, CXCR5loICOSint und CXCR5hiICOShi) isoliert. Alle drei Populationen zeigen im Unterschied zu Memory/Effektor CD4 T-Zellen aus peripherem Blut ein eine sehr restriktives Expressionsmuster für Chemokinrezeptoren. CXCR5loICOSint und CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen unterscheiden sich zudem nicht in ihrer chemotaktischen Antwort auf CXCL13. Im direkten Vergleich zeigte sich, dass nur CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen effektive B-Zell-Hilfe leisten, indem sie autologe B-Zellen stimulieren, IgG zu sekretieren. Interessanterweise sekretieren CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen gleichzeitig große Mengen CXCL13. Im Vergleich zu CXCR5-ICOS-/lo und CXCR5loICOSint Zellen zeigen CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen jedoch eine deutlich geringere Proliferation und eine starke Neigung zur Apoptose; beides könnte ein Hinweis auf einen terminalen Differenzierungszustand dieser Zellen sein. Bisher wurde angenommen, dass es sich bei den Zellen mit B-Helfer Funktion tatsächlich um die Fraktion der CD57+ CD4 T-Zellen handelt, da CD57+ CD4 T-Zellen eine stärkere Sekretion von IgG durch B-Zellen induzieren als CD57- CD4 T-Zellen. Allerdings zeigte sich beim Vergleich von CD57+ und CD57- CD4 T-Zellen der CXCR5loICOSint und CXCR5hiICOShi Populationen, dass die Stimulierung der IgG Sekretion durch B-Zellen unabhängig von CD57, aber abhängig vom Expressionslevel von ICOS und CXCR5 ist. Dieses Ergebnis stützt unsere Hypothese, dass es sich bei CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen um follikuläre B-Helfer T-Zellen handelt, während es sich bei einem Teil der CXCR5loICOSint CD4 T-Zellen vermutlich um Vorläufer dieser Zellen handelt. Im Gegensatz dazu repräsentieren CXCR5-ICOS-/lo CD4 T-Zellen überwiegend Antigen-unerfahrene T-Zellen, eine Annahme die durch den hohen Anteil an CD45RA exprimierenden Zellen in dieser Population unterstützt wird. Für die vergleichende Analyse der Genexpression und zur Identifizierung von Genen, die eine besondere Rolle für die Funktion oder Differenzierung von TFH-Zellen besitzen wurden mit Hilfe von DNA-Microchips globale mRNA Expressionsprofile für die tonsillären CD4 T-Zell-Populationen sowie naive und Effektor/Memory T-Zell-Populationen aus peripherem Blut erstellt. Die Analyse ergab, dass es sich bei CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen um eine distinkte Zellpopulation handelt, die nur entfernt mit anderen Effektor/Memory T-Zell- Populationen verwandt ist. Zudem zeigte sich, dass CXCR5loICOSint CD4 T-Zellen in Bezug auf die Expression vieler Gene eine Zwischenstellung zwischen CXCR5-ICOS-/lo und CXCR5hiICOShi CD4 T-Zellen einnehmen, was ein weiteres Indiz für das Vorkommen von TFH-Vorläuferzellen in dieser Zellpopulation ist. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse darauf hin, dass B-Zell-Hilfe während der Keimzentrumsreaktion nicht über klassische T-Helfer 1 und T-Helfer 2 Zellen erfolgt, sondern über eine hoch spezialisierte Population von TFH- Zellen, die ausschließlich in sekundären lymphatischen Organen vorkommen ist. Die Analyse der differentiellen Expression von Genen ergab, dass sich TFH- Zellen eindeutig über ihr Genexpressionsmuster von anderen Effektor/Memory T -Zell-Populationen unterscheiden. Die Genexpressionsanalyse ergab zudem Hinweise auf wichtige Gene und Signalwege, die bisher nicht mit der Differenzierung oder Funktion von T-Helferzellen assoziiert wurden und damit Ansatzpunkte für künftige Projekte in diesem Bereich bieten.