Angiotensin-converting enzyme 2-independent action of presumed angiotensin- converting enzyme 2 activators: studies in vivo, ex vivo, and in vitro

Abstract

The renin-angiotensin system (RAS) constitutes one of the pivotal systems in the physiological regulation of blood pressure and volume homeostasis. The balance between the classical Angiotensin-converting enzyme (ACE) – Angiotensin II (Ang II) – Angiotensin type 1 receptor (AT1R) axis, promoting vasoconstriction, and the antagonistic Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) – Ang (1-7) – Mas-Receptor axis is critical for a functional RAS. Dysregulation between those branches is considered to play a major role in the pathophysiology of various cardiovascular disorders. The peptidase ACE2 assumes a key position in this system due to the capability of metabolizing the vasoconstrictive octapeptide Ang II, through carboxyterminal cleavage of the amino acid phenylalanine, to Ang (1-7). This peptide is regarded as a natural antagonist of Ang II, due to its vasodilatory, antioxidative and antithrombotic properties. Enhancing the activity of ACE2 and thus amplifying the degradation of Ang II would be a novel approach to the treatment of cardiovascular diseases. 1-[(2-dimethylamino)ethylamino]-4-(hydroxymethyl)-7-[(4-methylphenyl) sulfonyl oxy]-9H-xanthene-9-one (XNT) and diminazene (DIZE) have shown, in several reports, to exert various organ-protective effects. The premise of the observed effect has always been the activation of ACE2 and the resulting increase in Ang II degradation. In this study, the two compounds were investigated in vivo, ex vivo and in vitro with regard to potential effects on blood pressure, Ang II degradation and ACE2 activity. In a model of Ang II- induced acute hypertension, administration of an Ang II Bolus under XNT resulted in an accelerated recovery in wild-type mice (WT) without an increase in either renal or plasma ACE2 activity. In the same model, XNT did not elicit an alteration in Plasma Ang II and Ang (1-7) levels. The antihypertensive effect of XNT was unexpectedly also found in WT-mice pretreated with an ACE2 inhibitor as well as in ACE2 knockout mice. Ex vivo experiments in mouse- and rat kidneys were moreover not showing an increase in ACE2 activity after incubation with Ang II and either XNT or DIZE. Furthermore, in vitro experiments showed that ACE2 activity and Ang II degradation were not enhanced in the presence of either compound. In fact, at very high concentrations, an antagonistic effect towards different enzymes of the RAS was observed. In summary, the in vivo-studies show that the antihypertensive effect of XNT is based on an ACE2-independent mechanism. The ex vivo- and in vitro-studies suggest that the other beneficial effects of both XNT and DIZE should not be attributed to ACE2 activation.

Das Renin-Angiotensin-system (RAS) ist eines der zentralen Hormonsysteme in der Steuerung des Blutdrucks sowie des Elektrolyt- und Wasserhaushaltes. Ausschlaggebend für die Funktionsfähigkeit des RAS ist das Gleichgewicht zwischen der vasokonstriktorisch wirksamen Achse Angiotensin-converting enzyme (ACE) – Angiotensin II (AngII) – Angiotensin type 1 receptor (AT1R) und der antagonistischen Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) – Ang (1-7) – Mas- Receptor Achse. Eine Dysregulation zwischen diesen Zweigen wird als wesentlicher Faktor in der Pathogenese verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen betrachtet. Die Peptidase ACE2 nimmt dabei eine Schlüsselposition ein, durch die Fähigkeit das vasokonstriktorisch wirkende Oktapeptid Ang II, mittels carboxyterminaler Abspaltung der Aminosäure Phenylalanin, in Ang (1-7) zu metabolisieren. Dieses Peptid wird heute angesichts seiner vasodilatorischen, antioxidativen und antithrombotischen Effekten als natürlicher Antagonist von Ang II verstanden. Eine Aktivierung von ACE2 stellt somit einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie kardiovaskulärer Erkrankungen dar. Den Substanzen 1-[(2-dimethylamino)ethylamino]-4-(hydroxymethyl)-7-[(4-methylphenyl) sulfonyl oxy]-9H-xanthene-9-one (XNT) und Diminazen (DIZE) wurden, unter der Prämisse einer solchen ACE2-Aktivierung, in zahlreichen Studien diverse organo- protektive Effekte nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von XNT und DIZE auf den Blutdruck, den Ang II-Abbau und die ACE2-Aktivität in vivo, ex vivo und in vitro untersucht. In einem Mausmodell für Ang II-induzierten Hypertonus zeigte sich der Blutdruck nach Bolusinjektion von Ang II in Wildtypmäusen (WT) unter XNT-Gabe signifikant schneller rückläufig ohne dass eine Veränderung von renaler und plasmatischer ACE2-Aktivität nachgewiesen werden konnte. Die Gabe von XNT bewirkte im gleichen Modell keine Veränderung der Plasmaspiegel von Ang II und Ang (1-7). Allerdings stellte sich der antihypertensive Effekt von XNT unerwartet auch in mit einem ACE2-Inhibitor vorbehandelten WT-Mäusen sowie in ACE2 Knockout-Mäusen dar. In zusätzlichen ex vivo Experimenten in Maus- und Rattennieren konnte durch XNT oder DIZE keine erhöhte ACE2-Aktivität ausgelöst werden, ebenso zeigte sich in vitro weder eine erhöhte ACE2-Aktivität noch ein veränderter Ang II Abbau unter XNT oder DIZE. Vielmehr zeigte sich bei sehr hohen Konzentration beider Moleküle ein antagonistischer Effekt auf verschiedene Enzyme des Renin-Angiotensin- Aldosteron System im Sinne einer unspezifischen Hemmung. Zusammenfassend zeigen die in vivo-Studien, dass die Blutdrucksenkung durch XNT auf ACE2-unabhängigen Mechanismen beruht. Die Ergebnisse der ex vivo- und in vitro-Studien legen nahe, dass auch andere vorteilhafte Effekte von XNT und DIZE, die bisher beschrieben wurden, nicht einer ACE2-Aktivierung zugeschrieben werden können.