dc.contributor.author
Kastner, Christian
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:24:21Z
dc.date.available
2012-01-03T09:18:50.061Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13332
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17530
dc.description
Inhaltsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Funktionen und Feinbau der Niere 1.1.1
Regulationsmechanismen der Niere 1.2 Wichtige Transportproteine und
Wasserkanäle für den epithelialen Natrium- und Wassertransport in der Niere
1.2.1 Regulation des Epithelialen Natriumkanals 1.3 Nierenschäden, Proteinurie
und Volumendysregulation 1.3.1 Nierenschäden und Bluthochdruck 1.3.2
Proteinurie und Ödembildung 1.3.3 Lokalisation der Natriumretention bei
proteinurischen Nierenerkrankungen 1.4 Die anti-glomeruläre-Basalmembran-
Glomerulonephritis 1.5 Die konditionelle partielle Megalin-knockout-Maus 2
Herleitung der Aufgabenstellung der Arbeit 3 Material und Methoden 3.1
Lösungen, Puffer und Medien 3.2 Versuchstiere 3.2.1 Das anti-GBM-GN-Modell 3.3
Physiologische Analysen 3.3.1 Blutdruckmessung 3.3.2 Analyse von Urin- und
Plasmaparametern 3.4 Perfusionsfixierung, Organentnahme und Gewebeaufbereitung
3.5 Molekularbiologische Analysen 3.5.1 mRNA-Extraktion 3.5.2 Reverse
Transkription und Polymerase-Kettenreaktion 3.5.3 TaqMan real-time
quantitative PCR 3.6 Proteinchemische Analysen 3.6.1 Zellfraktionierung 3.6.2
Bestimmung der Proteinkonzentration 3.6.3 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE) und Immunoblotting 3.6.4 NHE-Aktivitätsmessung 3.7 Morphologische
Techniken 3.7.1 Immunhistochemie 3.7.2 Verwendete Antikörper 3.7.3
Quantifizierung des COX-2 und Renin-Gehaltes 3.8 Datenquantifizierung und
statistische Analyse 3.9 Produktion von Antikörpern gegen den epithelialen
Natriumkanal 3.9.1 Expression rekombinanter GST-ENaC-Fusionsproteine in E.
coli 3.9.2 Isolation und Aufreinigung der rekombinanten GST-ENaC-
Fusionsproteine 3.9.3 Antiseren aus Kaninchen und Affinitätsreinigung 3.10
Suche nach enzymatischen Schnittstellen in künstlichen Maus-alpha- und gamma-
ENaC-Peptiden 3.10.1 Inkubation der künstlichen Peptide mit immobilisiertem
Sammelurin 3.10.2 Massenspektrometrische Analyse der Peptide (MALDI-TOF) 4
Ergebnisse 4.1 Klinische und physiologische Parameter 4.2 Analyse von
proximal-tubulären Na+-Transportern und AQP1 4.3 Analyse von distal-tubulären
Na+-Transportern und AQP2 4.4 Suche nach enzymatischen Schnittstellen in
künstlichen Maus-alpha- und gamma-ENaC-Peptiden 5 Diskussion 5.1 anti-GBM-GN
und RME-Defizienz in der Maus und ihr Einfluss auf renale Natriumtransporter
und Wasserkanäle 5.2 Schnittstellen in den extrazellulären Schleifen von
alpha- und gamma-ENaC 6 Zusammenfassung Kurzfassung Abstract
Literaturverzeichnis Danksagung Lebenslauf
dc.description.abstract
Humane glomeruläre Entzündungen sind ist durch Proteinurie gekennzeichnet und
können mit Natriumretention, Bluthochdruck und Ödembildung einhergehen. Hohe
Mengen an filtriertem Protein gelangen in den Nierentubulus, wo sie den
epithelialen Transport verändern können. Eine durch Proteinurie erhöhte
Proteinendozytose mit zellulärer Überladung kann den proximalen Tubulus
beeinträchtigen, jedoch wurden auch intrinsische Funktionsstörungen distaler
Epithelien beschrieben. Um die mögliche Beteiligung einzelner Tubulussegmente
an Funktionsstörungen des Natrium- und Volumenhaushalts bei proteinurischer,
glomerulärer Erkrankung aufzuklären, wurde eine anti-GBM-Glomerulonephritis
(GN) in einer Mauslinie mit einer nierenspezifischen Megalin-Teildefizienz
induziert, die eine verminderte rezeptorvermittelte Endozytose aufweist. GN-
Mäuse mit bzw. ohne durch Megalin-Teildefizienz bedingten Endozytosedefekt
wiesen bei einer Proteinurie von 10-15 mg/24 h eine reduzierte fraktionelle
Natriumexkretion und einen erhöhten systolischen Blutdruck auf. Der
Endozytosedefekt rief im proximalen Tubulus eine erhöhte epitheliale
Expression von NaPi-IIa und AQP1 hervor, aber keine Veränderung von NHE3. Die
GN bewirkte, unabhängig von Megalin, jedoch eine generell verminderte NaPi-
IIa- und AQP1-Expression, sowie eine verringerte NHE3-Aktivität, die
vermutlich durch eine andere NHE-Isoform kompensiert war. Hingegen konnten im
Verbindungstubulus und im Sammelrohr eine erhöhte ENaC-Expression bei
tubulärer und glomerulärer Proteinurie gefunden werden. Immunblots zeigten
neben den charakteristischen full-length-Banden der alpha- und gamma-
Untereinheiten von ENaC signifikante Zunahmen zusätzlicher, kleinerer ENaC-
Spaltprodukte. Die Auswirkungen auf diese Zunahmen waren bei der glomerulären
Proteinurie stärker als bei einer durch verminderte rezeptorvermittelte
Endozytose hervorgerufenen niedermolekularen Proteinurie. Die vermehrt
auftretenden, kleineren alpha- und gamma-ENaC-Banden weisen auf eine
verstärkte proteolytische Spaltung des ENaC hin, welche zur Erhöhung der ENaC-
Aktivität beitragen kann. Erhöhte immunhistochemische Signale der alpha-
Na,K-ATPase im Verbindungstubulus deuten zusammen mit einer erhöhten apikalen
ENaC-Expression und dem Auftreten vermutlicher ENaC-Spaltprodukte auf eine
lokal verstärkte Natriumretention hin. An Affinitätsbeads immobilisierter
Sammelurin aus Megalin-teildefizienten Mäusen wurde mit künstlichen Peptiden
mit Sequenzen aus den extrazellulären Schleifen der alpha- und der gamma-ENaC-
Untereinheit inkubiert. Die Peptide wurden danach mit der MALDI-TOF-
Massenspektrometrie analysiert. Gefundene Schnittstellen belegen die
proteolytische Wirkung der Proteasen Plasmin, TMPRSS4 und Kallikrein 1. Die
gewonnenen Ergebnisse stützen das Konzept einer Natriumretention sowohl bei
tubulärer wie auch bei glomerulärer Proteinurie als mögliche Ursachen für
Bluthochdruck und Ödembildung bei glomerulären Entzündungen.
de
dc.description.abstract
Human glomerular inflammatory diseases are accompanied by sustained
proteinuria and may involve sodium retention, hypertension, and edema
formation. High quantities of filtered protein enter the renal tubule, where
they may alter epithelial transport functions. Exaggerated protein endocytosis
caused by proteinuria, and consequent protein overload may affect proximal
tubules, but intrinsic malfunction of distal epithelia has also been reported.
In order to elucidate a possible involvement of particular tubule segments in
disturbances of sodium and volume handling occurring in proteinuric
glomerulopathy, an anti-GBM glomerulonephritis (GN) was induced in a mouse
strain with a kidneyspecific megalin-deficiency, featuring blunted receptor
mediated endocytosis. Treated mice with or without endocytosis defect caused
by megalin-deficiency showed a reduced fractional sodium excretion, and
elevated systolic blood pressure when proteinuria had reached 10-15 mg/24 h.
Blunted endocytosis caused in part an increased epithelial expression of NaPi-
IIa and AQP1, but did not change NHE3 abundance. However, GN reduced NaPi-IIa
and AQP1 expression independently from megalin, and decreased NHE3 activity as
well, which was probably balanced by another NHE isoform. However, in the
connecting tubule and the collecting duct, an increased ENaC expression was
found both under tubular and glomerular proteinuria. Immunoblots of ENaC
showed, in addition to the characteristical full-length bands of its alpha-
and gamma-subunits, significant increases of additional, smaller cleavage
products of the channel. The effects of glomerular proteinuria dominated over
those of a low molecular weight proteinuria, caused by blunted proximal
endocytosis, in their contributions to the increments of smaller bands of the
ENaC subunits. Increased abundances of smaller alpha- and gamma-ENaC bands
suggest a proteolytic cleavage of ENaC, which contribute to an elevated
channel activation. With GN, enhanced immunohistochemical signals of alpha-
Na,K-ATPase in the connecting tubule in conjunction with increased ENaC
surface expression, and the abundance of the putative ENaC cleavage products
point to locally elevated sodium retention. Accumulated urine from megalin-
deficient mice was immobilized to affinity beads and incubated with
synthesized peptides, containing sequences from the extracellular loops of the
alpha- and gamma-ENaC subunits. The peptides were subsequently analyzed by
MALDI-TOF mass spectrometry. Cleavage sites found account for the proteolytic
action of the filtered plasma protease plasmin and proteases secreted from the
tubular epithelium like TMPRSS4 and kallikrein 1. The data obtained thus
support the concept of sodium retention in both tubular and glomerular
proteinuria as possible causes for hypertension and edema formation occurring
in glomerular inflammatory diseases.
en
dc.format.extent
103 Bl.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Glomerulonephritis
dc.subject
Volumenretention
dc.subject
Natriumretention
dc.subject
proteolytische Spaltung
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::573 Einzelne physiologische Systeme bei Tieren
dc.title
Tubuläre Volumenregulation bei Glomerulonephritis in der Megalin-
teildefizienten Maus
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Sebastian Bachmann
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Udo Heinemann
dc.date.accepted
2011-11-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000035307-9
dc.title.translated
Tubular volume regulation in glomerulonephritis in mice with partial
deficiency for megalin
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000035307
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010500
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access