Einflüsse von Genistein und Fenofibrat auf den hepatischen Lipidstoffwechsel im in vitro-Modell der Steatosis hepatis

Abstract

Die Nicht-alkoholische Fettlebererkrankung (NAFLD) stellt aufgrund der steigenden Prävalenz des metabolischen Syndroms nicht nur in der gesamten Medizin eine Herausforderung dar. Insbesondere in der Leberchirurgie geht eine Steatosis hepatis bei Leberteilresektionen oder Transplantationen mit einem erheblichen zusätzlichen Risiko einher. Bisherige Untersuchungen zum Isoflavon Genistein deuten auf einen Nutzen in der Therapie der NAFLD hin, u.a. durch Senkung des Lipidgehalts der Leber. In der vorliegenden Arbeit wurde an primären humanen Hepatozyten von insgesamt 16 Spendern ein in vitro-Modell der Steatosis hepatis entwickelt und bezüglich der Zytotoxizität, der metabolischen Aktivität und der Expression der zentralen Rezeptoren PPARα und SREBP-1c mit ihren Zielgenen CPT1L, ACSL und FASN charakterisiert. In einem zweiten Schritt wurden der PPARα-Agonist Fenofibrat und das Isoflavon Genistein in den Konzentrationen 0, 1, 75 μM bzw. 0, 1, 5, 10, 50, 100 μM appliziert und Veränderungen im Lipidgehalt, in der Zytotoxizität und metabolischen Aktivität bestimmt. Des weiteren wurde auf Transkriptions- und Proteinebene die Expression von PPARα und SREBP-1c sowie ihrer Zielgene CPT1L, ACSL und FASN untersucht. Die Untersuchungen ergaben ein in vitro-Modell der Steatosis hepatis mit geringer Zytotoxizität, welches eine verstärkte Transkription von PPARα und dessen Zielgene ACSL und CPT1L sowie eine verringerte Transkription von SREBP-1c und FASN zeigte. Auf Proteinebene zeigte sich die Erhöhung von PPARα insbesondere im Zytosol. Die Steatosis bewirkte eine verstärkte Translokation von SREBP-1c in den Zellkern, korrelierend mit einer verringerten Proteinkonzentration im Membran-gebundenen Anteil. Die Zugabe von Fenofibrat erzielte eine Induktion von PPARα auf mRNA- und Proteinebene, vorrangig in den nicht- steatotischen Zellen. Gleichzeitig wurde die Transkription von SREBP-1c erhöht. Die Zugabe von Genistein zeigte in höheren Konzentrationen relevante zytotoxische Effekte, während die metabolische Aktivität wenig beeinflusst wurde. Der Fettgehalt veränderte sich unter den Bedingungen nicht. Auf mRNA-Ebene zeigte Genistein keinen eindeutigen, signifikanten Effekt auf PPARα, CPT1L oder ACSL. Bei SREBP-1c sowie FASN konnte man jedoch in der unbehandelten und in der steatotischen Gruppe eine Verringerung durch Genistein verzeichnen. Auf Proteinebene konnte dies nur in der nicht-steatotischen Gruppe bestätigt werden. Die Konzentration an PPARα wurde durch Genistein tendenziell erhöht, jedoch ohne statistische Signifikanz. Die vorliegende Arbeit zeigte zum einen ein in vitro-Modell der Steatosis hepatis an primären humanen Hepatozyten auf, welches keine relevante Toxizität verursachte. Zum anderen stellen die Untersuchungen von Fenofibrat und Genistein mögliche positive Einflüsse auf den hepatischen Lipidmetabolismus dar. Die Ergebnisse sind im Kontext des Modellcharakters zu sehen. Sie deuten jedoch auf einen Ansatzpunkt von Genistein hin, die NAFLD und die damit einhergehenden klinischen Konsequenzen zu behandeln.

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) represents a major challenge not only in medicine, considering the increasing prevalence of the metabolic syndrome. Especially in hepatic surgery, steatosis hepatis is associated with a considerable additional risk in liver resection or liver transplantation. Preliminary findings of the isoflavone Genistein indicate a beneficial effect in the therapy of NAFLD, among others by reducing lipid content of the liver. In the present work, primary human hepatocytes by a total of 16 donors were used to develop an in vitro model of steatosis hepatis. It was characterised in cytotoxicity, metabolism and in the expression of the lipid receptors PPARα and SREBP-1c as well as their target genes CPT1L, ACSL and FASN. In a second step, the PPARα agonist Fenofibrate and Genistein were administered in concentrations of 0, 1, 75 μM and 0, 1, 5, 10, 50, 100 μM, respectively. Changes in lipid content, cytotoxicity and metabolic activity were determined. Furthermore, mRNA and protein content of PPARα and SREBP-1c as well as their target genes CPT1L, ACSL and FASN were investigated. The results revealed an in vitro model of steatosis hepatis with a low degree of cytotoxicity. Transcription of PPARα as well as its target genes CPT1L and ACSL was increased, whereas SREBP-1c and FASN was lowered. On protein level, PPARα concentration was raised, especially in the cytosolic compartment. In steatotic cells, translocation of SREBP-1c from the membranous to the nuclear compartment was increased. Therefore, induction of steatosis enhanced the turnover of free fatty acids. Administration of Fenofibrate led to an induction of PPARα mRNA and protein content, primarily in non-steatotic cells. Also, transcription of SREBP-1c was increased. Administration of Genistein resulted in substantial toxic effects only at high concentrations, whereas metabolic activity was unaffected. In this setting, lipid content remained unchanged by Genistein. Regarding mRNA content, Genistein had no clear significant effect on PPARα, CPT1L or ACSL. However, Genistein led to a decrease of mRNA of SREBP-1c and FASN. On protein level, this was replicable only in the non-steatotic group. Protein content of PPARα was slightly raised by Genistein, without statistic significance. This work presents a conclusive in vitro model of steatosis hepatis in primary human hepatocytes without relevant cytotoxicity. Also, the results of Fenofibrate and Genistein administration showed possible favourable effects on hepatic lipid metabolism. The findings have to be looked at in a model setting. They however point towards an objective for Genistein to approach NAFLD and its clinical implications.