Untersuchung des Beitrags von ETV6/RUNX1 zur Entstehung akuter lymphatischer Leukämie (ALL) im Kindesalter

Abstract

Die Translokation t(12;21) tritt in 25% pädiatrischer B-Vorläuferzell-ALL auf. Sie resultiert in der Fusion der für die Hämatopoese relevanten Transkriptionsfaktorgene ETV6 und RUNX1 und der Expression eines chimären Fusionproteins, das als dominant negativer Repressor von RUNX1-Zielgenen wirkt. Es wird angenommen, dass ETV6/RUNX1 über die Veränderung des Transkriptoms der Zelle direkt zur Leukämogenese beiträgt. Um die Auswirkungen der ETV6/RUNX1-Expression zu untersuchen, wurde ein zelluläres Sytems mit stabiler Expression des Fusionsgens etabliert. Dazu wurde das Transgen unter der Kontrolle eines Tetrazyklin-induzierbaren Promotors mittels retroviralem Getransfer in die murine pro-B-Zelllinie BaF3 eingebracht. Häufige Mutation der Transgen- und der Vektorsequenz waren z.T. auf homologe Sequenzen im minimalen Promotor des Tet-Systems zurückzuführen und erforderte die Selektion einzelner BaF3-Klone. Die Expression von ETV6/RUNX1 resultierte in einer schwachen, aber signifikanten Verzögerung des Übergangs der Zellen von der G1- in die S-Phase des Zellzyklus, wie sie auch für andere core binding factor- Fusionsproteine, die mit der RUNX1-Transaktivierung der Genexpression interferieren, beobachtet wurde. Proliferation und Apoptose blieben unbeeinflusst und ETV6/RUNX1 vermittelte kein IL-3-unabhängiges Wachstum in BaF3-Zellen. In genomweiten Genexpressionsanalyse mittels Microarray- Technologie wurden 181 differenziell exprimierte Gene in der Gruppe der ETV6/RUNX1-positiven BaF3-Klone identifiziert (77 hoch- und 104 herunterregulierte Gene). Gene mit einem Fold Change > 2 (n = 66) wurden nicht ko-reguliert, obwohl etwa 50% dieser Gene potenzielle RUNX1-Bindungsstellen im Promotor aufweisen. Die GO-Kategorien „defense response“ und „response to biotic stimulus“ waren durch die 14 hochregulierten Gene Blnk, CD55, IL8rb, Cblb, Nalp10, Tnf, Apaf1, Prkca, Slamf1, Ifi47, Lta, Lilrb3, IL-6, Lat2 überrespräsentiert sowie die Kategorie „basolateral plasma membrane“ durch die fünf hochregulierten Gene Col17a1, Itga4, Itga6, Slc12a6 und Bcar1. Es wurden verschiedene Genen, die mit der Entwicklung hämatopoetischer Zellen assoziiert sind, differenziell exprimiert, darunter Lat2, Lat, Lilrb, Blnk, Pik3cd, BRDG-1, die mit dem Signalweg des prä-B-Zellrezeptors assoziiert sind. Die Expression von ETV6/RUNX1 führte in BaF3-Zellen zur ektopen Sekretion von IL-6. Dies ist eine interessante Beobachtung, da IL-6 Proliferation, Überleben und das Selbsterneuerungspotenzial hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen stimuliert sowie als autokriner Wachstumsfaktor in Tumorzellen wirkt. Der Serinproteaseinhibitor SerpinB1a war auf mRNA- und Proteinebene am stärksten hochreguliert. Ein zytoprotektiver Effekt von SerpinB1a gegen TNF-alpha, wie er für die Serinproteaseinhibitoren PAI2 und PI10 in HeLa-Zellen nachgewiesen wurde, wurde in BaF3-Zellen nicht beobachtet, schliesst jedoch nicht aus, dass andere Funktionen von SerpinB1a für die Leukämogenese relevant sein können.

The translocation t(12;21) is the most common chromosomal aberration in pediatric B-cell precursor ALL. It fuses the N-terminus of ETV6 to nearly all of the RUNX1 gene, both coding for transcription factors that play an essential role in hematopoiesis. The chimeric fusion protein ETV6/RUNX1 acts as a dominant negativ repressor on RUNX1 target genes. Therefore ETV6/RUNX1 is thought to contribute directly to leukemogenesis via imposition of an altered pattern of RUNX1 target gene expression. In order to identify genes that are dysregulated in the context of ETV6/RUNX1 expression, a cellular system with stable expression of the fusion gene was established. ETV6/RUNX1 under the control of a tetracycline-inducible promotor was inserted in the murine pro-B cell line BaF3 via retroviral gene transfer. Frequent mutations in the transgene and vector sequence resulted in part from homologous sequences in the minimal promoter of the Tet-system and required selection of individual BaF3 clones. Expression of ETV6/RUNX1 resulted in a slight but significant delay of progression from G1- to S1-phase of cell cycle, as it can also be observed for other core binding factor-fusion proteins, that interfere with RUNX1-mediated transactivation of transcription. There was no effect on proliferation and apoptosis and ETV6/RUNX1 did not confer IL-3-independet growth to BaF3 cells, pointing to a weak transforming potential for ETV6/RUNX1. Genome-wide gene expression anlysis using microarray technology revealed 181 differentially expressed genes (77 up-regulated and 104 down- regulated genes) in BaF3 clones expressing ETV6/RUNX1. Genes with a fold change > 2 (n = 66) were not transcriptionally co-regulated, although more than 50 % of these genes exhibited potential RUNX1-binding sites in their promoter. Gene ontology categories „defense response“ and „response to biotic stimulus“ were over-represented due to 14 up-regulated genes (Blnk, CD55, IL8rb, Cblb, Nalp10, Tnf, Apaf1, Prkca, Slamf1, Ifi47, Lta, Lilrb3, IL-6, Lat2) and „basolateral plasma membrane“ due to 5 up-regulated genes (Col17a1, Itga4, Itga6, Slc12a6 und Bcar1). Several genes involved in development of hematopoietic cells were differentially expressed, among them Lat2, Lat, Lilrb, Blnk, Pik3cd, BRDG-1, which are associated with the pre-B-cell receptor signalling pathway. Expression of ETV6/RUNX1 resulted in ectopic secretion of IL-6. This finding is of special interest, because IL-6 stimulates proliferation, survival and self-renewal of hematopoietic stem and progenitor cells and acts in an autocrine fashion in various tumor cells. SerpinB1a, a serine protease inhibitor, was the most up-regulated gene and protein, respectively. While serin protease inhibitors PAI2 and PI10 confer cytoprotectivity against TNF-alpha in HeLa cells, this effect could not be observed for SerpinB1a in BaF3 cells. However, other functions of SerpinB1a might be essential for leukemogenesis in the context of ETV6/RUNX1 expression.