Möglichkeiten und Grenzen der klonspezifischen, quantitativen Real-Time-PCR bei Patienten mit Sézary Syndrom

Abstract

Die quantitative Real-Time-PCR (RT-Q-PCR) ist als sensitive Methode zur Quantifizierung kleinster Mengen residueller Tumorzellen sog. minimal residual disease oder minimaler Rester-krankung (MRD) für Patienten mit akuter lymphoblastischer T-Zell-Leukämie (T-ALL) etabliert. Die MRD Diagnostik ist für eine individuelle Therapiegestaltung, Evaluation verschiedener Therapieoptionen von Bedeutung und kann helfen Risikogruppen mit schlechter Prognose zu identifizieren. Das Sézary Syndrom (SéS) ist eine aggressive Form der kutanen T-Zell-Lymphome (CTCL) charakterisiert durch die Aussaat atypischer Zellen in das Blut, eine Erythrodermie und einer generalisierten Lymphadenopathie. Aktuell existiert keine Methode zur spezifischen Quantifizierung neoplastischer Zellen bei Patienten mit SéS. Im Rahmen der vorgelegten Arbeit entwickelten wir eine hochsensitive RT-Q-PCR für Patienten mit SéS. Als PCR target wurde das T-Zell-Rezeptor-Gen der β-Kette (TCR-β-R) der monoklonal expandierten Tumorzellpopulation gewählt. Das T-Zell-Rezeptor- Gen besteht aus mehreren Gen-segmenten. Während der physiologischen T-Zell- Proliferation werden verschiedene Gensegmente des T-Zell-Rezeptorgens kombiniert (kombinatorische Diversität). Durch zusätzliche Deletionen und Insertionen an den Junktionszonen (junktionale Diversität) ergibt sich ein weites Spektrum an unterschiedlichen Gensequenzen. Bei dem SéS liegt eine monoklonale Expansion von atypischen T-Zellen vor. Diese Tumorzellpopulation weist ein identisches Rearrangement des T-Zell-Rezeptorgenlocus auf, das z. B. mittels PCR nachgewiesen werden kann. In die Studie wurden 30 Proben von 14 Patienten eingeschlossen. Für alle Patienten wurde ein monoklonales TCR-β-R mittels Fluoreszenz-Fragmentlängen-Analyse nachgewiesen, nach stan- dardisiertem biomed-2-Protokoll amplifiziert (van Dongen et al., 2004) und sequenziert. Insge-samt wurden 20 N-D-N-spezifische Primer designt (Primer 3 Plus; www.bioinformatics.nl). Die RT-Q-PCR wurden mit der LightCycler Technologie unter Verwendung sequenzspezifischer TaqMan Sonden durchgeführt. Zur Optimierung der Reaktionsbedingungen wurden für alle 20 Primerpaare die Anlagerungstemperatur und die Primerkonzentration variiert. Zusätzlich wurde der Einfluss der Magnesium- und Sondenkonzentration im Reaktionsansatz untersucht. Die Quantifizierung der absoluten Tumorzellzahl erfolgte im Vergleich der Ct-Werte der Proben zu den Ct-Werten eine Verdünnungsreihe mit bekannter Genkopienzahl. Zur Herstellung der Ver-dünnungsreihen für alle Patienten wurden die Amplifikate der qualitativen PCR kloniert und seriell verdünnt. Zur Bestimmung der Gesamtzellzahl in den Patientenproben wurde kommerziell erworbene, polyklonale DNS und β-Aktin-spezifische Primer verwandt. Der β-Aktin-Gen- locus ist ein sog. housekeeping Gen und in humanen Zellen ubiquitär exprimiert. Aus beiden Bestimmungen wurde die relative Tumorzellzahl berechnet. Für alle 14 Patienten konnte eine hochsspezifische und sensitive RT-Q-PCR etabliert werden. Die Nachweisbarkeit lag bei fünf Patienten bei einer Zelle mit dem klonalen TCR-β-R unter 105 Gesamtzellen, ansonsten wurde, bis auf für einen Patienten des Kollektivs, mindestens eine Nachweisbarkeit von einer Zelle des klonalen TCR-β-R unter 103 Gesatmzellen erreicht. Insge-samt war Sensitivität geringer, als bei Patienten mit T-ALL (Brüggemann et al., 2004). Zur wei-teren Analyse wurden die N-D-N-Regionen eines erweiterten Patientenkollektivs (34 Patienten mit SéS) bezüglich Gesamtlänge und Länge der Gensegmente ausgewertet. Hier zeigte sich eine kürzere N-D-N- Region bei Patienten mit SéS, was allgemein das Primerdesign unflexibler ge-staltet. In 18 Proben von zwei Patienten wurden die Tumorzellzahl und die Gesamtzellzahl quan-tifiziert. Zur Beurteilung der Reliabilität wurde für zwei Proben eine Doppelbestimmung aus zwei unabhängigen Reaktionsansätzen durchgeführt. Bei drei Proben von einem Patienten lag die ermittelte Tumorzellzahl höher als die Gesamtzellzahl. Die CGH- Analyse des β -Aktin-Gens in Proben des Patienten zeigte eine Deletion. Diese genetische Veränderung kann in diesem Fall als ursächlich für eine falsch zu niedrig quantifizierte Gesamtzellzahl angesehen werden. In den übrigen Proben konnte die absolute und relative Tumorzellzahl bestimmt werden. Die Quantifizierungsergebnisse wurden mit relevanten Laborparametern und dem Hautbefund, unter Berücksichtigung der Therapie mit Alemtuzumab in zwei unterschiedlichen Dosierungen, verglichen. Insgesamt zeigte sich eine gute Korrelation zur CD4/CD8- Ratio. Unter der höher-dosierten Medikation mit Alemtuzumab ist eine fallende Tumorzellzahl im Blut bei einer Besse-rung des Hautbefundes messbar. Nach der Dosisreduktion sind die Parameter jedoch gegenläu-fig: Die relative Tumorzellzahl im Blut ist niedriger als zuvor messbar, bei einer Verschlechterung des Hautbefundes. Dies lässt eine unszureichende Wirkung von Alemtuzumab auf das Hautkompartiment in reduzierter Dosis annehmen. Der Abfall der relativen Tumorzellzahl im Blut bei Verschlechterung des Hautbefundes spricht eher für eine Migration der Lymphozyten, statt für einen realen Abfall der Tumorlast. Aufgrund der Migration im Blut zirkulierender Tumorzellen in das Hautkompartiment und gegebenenfalls sekundäre lymphatische Organe ergibt sich die Notwendigkeit, die Methode zur Beantwortung klinischer Fragestellungen und der Evaluation verschiedener Therapien auch für Gewebebiospien zu etablieren. Anderenfalls kann eine tatsächliche Reduktion bzw. ein tatsächlicher Anstieg der Tumorzellen von Schwankungen der Quantifizierungsergebnisse aufgrund von einem Übergang in die Haut nicht unterschieden wer-den. Insgesamt konnte eine hohe Spezifität und Sensitivität der RT-Q-PCR zur Quantifizierung von Tumorzellen bei Patienten mit SéS demonstriert werden. Gleichzeitig erwies sich die Methode als technisch anspruchsvoll und nicht für alle Patienten gleichwertig anwendbar. So wird die RT-Q-PCR für Studienzwecke interessant bleiben, auch wenn sie für die Routinediagnostik weniger geeignet scheint.

Quantitative real-time PCR (RT-Q-PCR) is a sensitive technique for the detection of minimal residual disease (MRD) in samples from patients with acute lymphoplastic leukemia. The MRD diagnostic is essential for the detection of incomplete remission, may help to identify patients with poor prognosis and provides insight into the effectiveness of different therapeutic options. Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) represent a heterogenous group of non-Hodgkin lymphomas with clonal T-cell- proliferation in the skin. Sézary syndrome (SéS) is an aggressive subtype of the CTCL characterized by erythroderma, generalized lymphadenopathy and atypical T-cells circulating in the blood. Up to now there has been no specific and sensitive method for MRD detection in patients with SéS. Therefore we developed a highly sensitive RT-Q-PCR which is specific for the rearranged T-cell-receptor-β-gene-locus (TCR-β-R) of the clonally expanded tumor cell population. We included 30 samples from 14 patients in our study; samples were collected during routine diagnosis. The clonal TCR-β-R were amplified by using the biomed-2 multiplex PCR assay and sequenced. We designed 20 primers complementary to the N-D-N junctional region specific for each patient by using Primer3Plus (www.bioinformatics.nl). For absolute quantification, the PCR- products of the qualitative PCR were cloned and serially diluted to serve as a standard curve in the following clonspecific RT-Q-PCR. To quantify the total cell count contained in the samples and later calculate the relative number of tumor cells, we used the β-actin gene locus and a dilution series of commercially available human genomic DNA. The RT-Q-PCR was accomplished by the LightCycler II instrument and TaqMan probes. To optimize reaction conditions, we varied the annealing temperature and primer concentration for the 20 primers. Moreover, we analyzed the influence of a varied concentration of MgCl2 and the TaqMan probes. We established the RT-Q-PCR for 14 patients. 13 reactions reached a sensitivity of at least one copy of the tumor cell- specific TCR-β-R among 1000 polyclonal cells. For the quantification we used 18 samples from two patients. In conclusion, the RT-Q-PCR is a highly specific and sensitive, though technically challenging and expensive method, for quantifying tumor cells in patients with SéS. Hence the RT-Q-PCR will be more interesting for scientific studies than for routine diagnostic application.