Untersuchungen molekularer Mechanismen zur transkriptionellen und epigenetischen Regulation des humanen vegfr-3 - Gens am Zellmodell

Abstract

Einleitung: Angiogenese, die Neubildung von Blutgefäßen aus endothelialen Vorläuferzellen, ist eine Voraussetzung für Wachstum und Disseminierung maligner Tumoren. Der Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) – Superfamilie konnte hierfür eine entscheidende Rolle zugeschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass der Tyrosinkinaserezeptor VEGFR-3 durch Bindung von VEGF-C und VEGF-D eine wichtige Funktion bei der Regulation von Lymphangiogenese und lymphatischer Metastasierung hat. Während eine Reihe regulierender Mechanismen für die Expression der Hämangiogenese-assoziierten Rezeptoren VEGFR-1 und VEGFR-2 identifiziert wurden, sind die molekularen Vorgänge zur Kontrolle der vegfr-3 – Genexpression noch nicht vollständig verstanden. Methodik: In Vorarbeiten der Arbeitsgruppe waren 1,9kb des 5’-flankierenden Promoterbereichs des humanen vegfr-3 – Gens kloniert und durch 5’-Deletionsanalysen ein GC-reiches, essentielles Promoterminimalelement identifiziert worden. Es wurden zwei GC-Boxen identifiziert, welche durch Zinkfingerproteine Sp1 und Sp3 gebunden und aktiviert werden. Nach der Ermittlung dieser strukturellen Charakteristika stand eine funktionelle Analyse der Bindungssequenzen und Transkriptionsfaktoren im Focus der vorliegenden Arbeit. Durch Mutation in den für die Bindung von Sp1/Sp3 notwendigen GC-Boxen und Klonierung des Minimalelements in das heterologe Promotersystem pT81 wurde die funktionelle Relevanz der GC-reichen Elemente untersucht, zudem wurde der Einfluss von Sp1/Sp3 in Überexpressionsstudien analysiert. Im zweiten Teil erfolgte eine Untersuchung des Einflusses epigenetischer Modifikationen durch Trichostatin A (TSA) – vermittelte HDAC- Inhibition und 5-Aza Desoxycytidin (5-Aza dC) - vermittelte DNA-Demethylierung auf die vegfr-3 - Expression sowie auf die Transaktivierung von Reportergenkonstrukten. Zusätzlich wurde der Stimulationseffekt auf die Promoterbindung von Sp1/Sp3 in EMSA-Studien sowie auf die Transaktivierung von Sp1/Sp3 in Gal4-Sp1-/Gal-4-Sp3 – Luciferase – Assays untersucht. Ergebnisse: Selektive Mutationen des Minimalelements zeigten, dass beide GC-Boxen funktionelle Relevanz aufweisen, jedoch die 5’-mutierte Sequenz einen signifikant geringer abgeschwächten Effekt hat als das 3’-mutierte Konstrukt. In Überexpressionsstudien konnte sowohl Sp1 als auch Sp3 eine aktivierende Funktion hinsichtlich der vegfr-3-Promoterregulation zugeordnet werden. TSA verursachte eine Hochregulation von vegfr-3 – mRNA sowie gesteigerte Transaktivierung von Reportergenkonstrukten. Analog hierzu führte 5-Aza dC in Zellinien ohne basale vegfr-3 - Expression zu einer Hochregulation von vegfr-3, in basal exprimierenden Zelllinien blieb dies ohne Effekt. In EMSA - Studien hatten beide Inhibitoren keinen Einfluss auf die Bindungskapazität von Sp1 und Sp3, dagegen steigerten sie ihre Transaktivierungskapazität in Gal4-Sp1-/Gal-4-Sp3 – Luciferase – Assays. Schlussfolgerung: Diese Studie beschreibt grundlegende molekulare Mechanismen der transkriptionellen Regulation des vegfr-3 – Gens und zeigt, dass Histonacetylierung und CpG – Methylierung wichtige Kontrollmechanismen der vegfr-3 – Expression darstellen. Sie trägt so zu einem besseren Verständnis der Rolle des vegfr-3 – Gens in der Tumorbiologie bei und könnte helfen, neue Interventionsstrategien zur Beeinflussung von tumorassoziierter Lymphangiogenese und/oder lymphatischer Metastasierung zu entwickeln.

Introduction: Angiogenesis, the formation of new blood vessels from endothelial precursors, is a prerequisite for growth and dissemination of solid malignancies. Multiple studies found a decisive role for the vascular endothelial growth factor (VEGF) superfamily. Previous works revealed that tyrosine kinase vegf receptor – 3 (VEGFR-3) regulates lymphangiogenesis and lymphatic metastasis through binding of VEGF-C and VEGF-D. While a variety of molecular mechanisms regulating the expression of the hemangiogenesis linked receptors VEGFR-1 and VEGFR-2 have been identified, the molecular components by which vegfr-3 gene expression is controlled are not fully understood. Methods: In previous works of our group 1.9kb of 5′-flanking DNA of the human vegfr-3 gene were cloned and a GC-rich promoter element was identified being essential for vegfr-3 transcription. Two GC-boxes were found which are bound and activated by zinc finger proteins Sp1 and Sp3. Following these structural findings the present work focused on a functional analysis of the binding sequences and transcription factors. By selective mutation of the Sp1/Sp3 binding GC-boxes and cloning of the minimal element into heterologous promotor system pT81 the functional relevance of the GC-rich elements and Sp1/Sp3 were analysed. Moreover the influence of Sp1/Sp3 was analysed in overexpression studies in drosophila SL-2 cells. Secondly, an investigation of the influence of epigenetic modifications on vegfr-3 expression was executed. Effects of Trichostatin A (TSA) – mediated HDAC – inhibition and 5-Aza desoxycytidine (5-Aza dC) - mediated promoter demethylation on vegfr-3 – mRNA expression and transactivation of vegfr-3 reporter gene constructs were analysed. Moreover their influence was analysed on promoter binding of Sp1/Sp3 in EMSA studies and transactivation of Sp1/Sp3 in Gal4-Sp1-/Gal-4-Sp3 – luciferase – assays. Results: Selective sequence mutation of the minimal promoter element revealed that both GC-boxes have functional relevance, showing a significantly weaker attenuation of transcriptional activity for the 5’-mutated than for the 3’-mutated construct. Overexpression studies showed activating functions of both Sp1 and Sp3 at the vegfr-3 promoter. TSA led to an up-regulation of mRNA levels and transactivation of reporter gene constructs. Similarly, 5-Aza dC reactivated vegfr-3 expression in basally non-expressing cell lines whereas stimulation remained effectless in cell lines basally expressing vegfr-3. Both inhibitors had no effect on promoter binding capacities of Sp1 and Sp3 in EMSA studies but increased their transactivating capacity in Gal4-Sp1-/Gal4-Sp3-luciferase assays. Conclusion: This study describes profound molecular mechanisms regulating vegfr-3 transcription and demonstrates that histone acetylation and CpG methylation are important control determinants of vegfr-3 expression. It contributes to a better understanding of the role of vegfr-3 within tumor biology and may help to develope new intervention strategies influencing tumor associated lymphangiogenesis and/or lymphatic metastasis.