Untersuchung proapoptotischer Signalwege für das maligne Melanom auf der Basis von proapoptotischen Bcl-2-Proteinen

Abstract

Derzeit gibt es keine wirksame Therapie für das metastasierte maligne Melanom. Die gezielte Induktion der Apoptose erscheint als ein vielversprechender Ansatz. Dabei stehen die pro- und antiapoptotischen Mitglieder der B-Zell- Lymphom-(Bcl)-2-Proteinfamilie im besonderen Fokus. In der vorliegenden Arbeit wurde die Induktion der Apoptose durch die proapoptotischen Bcl-2-Proteine Bcl-xAK, Bcl-xS und BimL in Melanomzellen untersucht. Für die effiziente Überexpression wurde die cDNA von Bcl-xAK, Bcl-xS und BimL durch die Klonierung in einen adenoviralen Expressionsvektor unter die Kontrolle eines Tet-OFF-Promotors (Tetracyclin) gestellt. Bcl-xAK ist ein proapoptotisches Spliceprodukt des bcl-x Gens, dem die BH3(Bcl-2-homologe)- Domäne fehlt und das stattdessen die BH2-, BH4- und Transmembrandomäne (TM) besitzt. Die BH3-Domäne der proapoptotischen Bcl-2-Proteine galt bisher für die Apoptoseinduktion und für die wechselseitige Regulation der Bcl-2-Proteine als unabdingbar, weshalb es unklar blieb, wie Bcl-xAK die Apoptose induzierte. Das adenovirale Konstrukt (AdV-AK) vermittelte sowohl eine starke Apoptoseinduktion als auch eine Abnahme der Zellproliferation und Zellviabilität in Melanom- und Nicht-Melanomzelllinien. Der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und das Freiwerden von Cytochrom c aus den Mitochondrien indizierten eine klare Aktivierung des mitochondrialen Apoptosesignalweges. Demzufolge schien die hier aufgezeigte mitochondriale Translokation von Bcl-xAK selbst der essentielle und initiale Schritt der Apoptoseinduktion zu sein. Die Bcl-xAK induzierte Apoptose war entscheidend von Bax oder Bak abhängig und wurde sowohl unter Bax/Bak-Doppel- Knockdown- Bedingungen als auch unter Bcl-2- oder Bcl-xL-Überexpressionsbedingungen aufgehoben. Eine direkte Interaktion mit den Proteinen der Bcl-2-Familie Bcl-2, Bax, Bad, Noxa oder Puma konnte mittels Immunpräzipitation jedoch nicht nachgewiesen werden. Das heißt, neben der BH3-vermittelten Interaktion existiert für die gegenseitige Regulation der Bcl- 2-Proteine ein zusätzlicher Weg, der unabhängig von der BH3-Domäne ist. Das proapoptotische Bcl-2-Protein Bcl-xS umfasst die Bcl-2-homologen Domänen BH3 und BH4 und induziert Apoptose in Abhängigkeit von Bak. Für die Untersuchung der Effizienz und des Signalweges von Bcl-xS wurde wiederum ein adenoviraler Vektor (AdV-XS) verwendet. Die Überexpression von Bcl-xS resultierte in einer effizienten Apoptoseinduktion und Aktivierung der Caspasen. Anzeichen für den mitochondrialen Apoptosesignalweg waren der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und die Freisetzung von Cytochrom c, AIF und Smac aus den Mitochondrien. In Melanomzellen zeigte sich eine signifikante Aktivierung von Bak durch Bcl-xS. Der Knockdown gegen Bak und die Bcl-xL-Überexpression verhinderten die Bcl-xS induzierte Apoptose, während der Knockdown von Mcl-1 dafür sensitivierte. Im Bezug auf die spezifische Rolle von VDAC2 (voltage- dependent anion channel) als Inhibitor von Bak konnten wir eine bemerkenswerte Interaktion zwischen Bcl-xS und VDAC2 in Melanomzellen identifizieren, welche sich mit einer reziproken Koimmunpräzipitationsanalyse bestätigte. Darüber hinaus zeigte Bcl-xS keine direkte Interaktion mit Bak. Des Weiteren war die Bindung von Bcl-xS an VDAC2 unabhängig von der Bak-Expression. Aus der Bcl-xS- Überexpression resultierte die Spaltung der VDAC2-Bak-Interaktion und führte zu einem Freiwerden von Bak aus dem VDAC2-Bak-Komplex. Die mechanistischen Zusammenhänge wurden durch die Tatsache unterstützt, dass die Bcl-xS induzierte Apoptose nach Überexpression von VDAC2 stark reduziert wurde. Für das proapoptotische BH3-only Protein Bim wurde keine signifikante Expression in einem Panel von verschiedenen Melanomzelllinien gefunden. Die BimL- Überexpression in Melanomzellen nach der Transduktion mit dem adenoviralen Vektor (AdV-BimL) resultierte in einer hoch effizienten Induktion der Apoptose mit einer kompletten Aufhebung der Zellproliferation. Die Aktivierung des mitochondrialen Apoptosesignalweges wurde durch den Verlust des mitochondrialen Membranpotentials, dem Freiwerden von mitochondrialen Apoptose induzierenden Faktoren und der Prozessierung der Caspase 9 ersichtlich. Einzel- Knockouts gegen Bax oder Bak konnten die BimL-induzierte Apoptose nicht unterdrücken. Demzufolge ist die BimL vermittelte Apoptose von Bax oder Bak abhängig. Besonders bemerkenswert war, dass BimL die Bcl-2-Überexpression, die als ein wesentlicher antiapoptotischer Faktor im Melanom gilt, komplett überwinden konnte. Diese deutliche Effizienz in Melanomzellen wurde mit der Interaktion von BimL mit allen antiapoptotischen Bcl-2-Proteinen in Verbindung gebracht. Diese Interaktionen konnten durch Koimmunpräzipitationsanalysen für Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 und Bcl-w gezeigt werden. Auf diese Weise zeigte BimL ein außergewöhnlich hohes proapoptotisches Potential in Melanomzellen. Strategien für die Reexpression von BimL erscheinen somit von besonderem Interesse. Derartige Strategien wurden für den B-Raf-Inhihibitor (Vemurafenib) berichtet, dessen Effizienz und Effektivität zumindest teilweise der Reexpression von Bim zugeschrieben werden konnte. Die hier identifizierte besondere Rolle der proapoptotischen Bcl-2-Proteine Bcl-xAK, Bcl-xS und BimL in der Apoptoseregulation von Melanomzellen könnte bei der Behandlung des malignen Melanoms genutzt werden, um die Apoptoseresistenz der Melanomzellen zu überwinden und die Wirksamkeit bestehender Therapieformen zu optimieren.

Apoptosis is a defined genetic death program that leads to ordered destruction of cellular components while membrane integrity is preserved. It also represents a safeguard mechanism against tumor formation, due to the elimination of altered and mutated cells. Thus, apoptosis resistance is characteristic for tumor cells, and therapeutic strategies aim to overcome this resistance. In the present study, the mechanism of Bcl-xAK-, Bcl-xS- and BimL-induced apoptosis was investigated in melanoma cells. For efficient overexpression, Bcl-xAK, Bcl-xS and BimL were subcloned in an adenoviral vector under Tet-OFF control. We recently described Bcl-xAK, a proapoptotic splice product of the bcl-x gene, which lacks BH3 but encloses BH2, BH4 and a transmembrane domain. The BH3 domain of Bcl-2 proteins was regarded as indispensable for apoptosis induction and for mutual regulation of family members. It remained however unclear, how Bcl-xAK may trigger apoptosis. The construct resulted in strong apoptosis induction with up to 50% apoptotic cells in melanoma and nonmelanoma cell lines as well as decreased cell proliferation and survival. Disruption of mitochondrial membrane potential, and cytochrome c release clearly indicated activation of the mitochondrial apoptosis pathways. Both Bax and Bak were activated as shown by clustering and conformation analysis. Mitochondrial translocation of Bcl-xAK appeared as an essential and initial step. Bcl-xAK was critically dependent on either Bax or Bak, and apoptosis was abrogated in Bax/Bak double knockout conditions as well by overexpression of Bcl-2 or Bcl-xL. A direct interaction with Bcl-2, Bax, Bad, Noxa or Puma was however not seen by immunoprecipitation. Thus besides BH3-mediated interactions, there exists an additional way for mutual regulation of Bcl-2 proteins, which is independent of the BH3. The proapoptotic Bcl-2 protein Bcl-xS encloses the Bcl-2 homology domains BH3 and BH4 and triggers apoptosis via the multidomain protein Bak, however the mechanism remained elusive. For investigating Bcl-xS efficacy and pathways, an adenoviral vector was constructed with its cDNA under Tet-Off control. Bcl-xS overexpression resulted in efficient apoptosis induction and caspase activation in melanoma cells. Indicative of mitochondrial apoptosis pathways, Bcl-xS translocated to mitochondria, disrupted the mitochondrial membrane potential and induced release of cytochrome c, AIF and Smac. In melanoma cells, Bcl-xS resulted in significant Bak activation, and Bak knockdown as well as Bcl-xL overexpression abrogated Bcl-xS-induced apoptosis, whereas Mcl-1 knockdown resulted in a sensitization. With regard to the particular role of VDAC2 (voltage-dependent anion channel) for inhibition of Bak, we identified here a notable interaction between Bcl-xSand VDAC2 in melanoma cells, which was proven in reciprocal coimmunoprecipitation analyses. On the other hand, Bcl-xS showed no direct interaction with Bak, and its binding to VDAC2 appeared as also independent of Bak expression. Suggesting a new proapoptotic mechanism, Bcl-xS overexpression resulted in disruption of the VDAC2-Bak interaction leading to release of Bak. No significant expression of the proapoptotic Bcl-2 protein Bim was obtained in a panel of melanoma cell lines. For re-expression, an adenoviral vector was constructed with the full- length cDNA of BimL under control of an inducible promoter. BimL overexpression resulted in highly efficient apoptosis induction in melanoma cells associated with complete abrogation of cell proliferation. Activation of mitochondrial apoptosis pathways was evident by disruption of the mitochondrial membrane potential, release of mitochondrial apoptogenic factors and caspase-9 processing. Apoptosis was induced both via Bax and Bak, and single knockdown of either Bax or Bak could not prevent BimL-induced apoptosis. Of particular note, BimL completely overrode the apoptosis blockade by Bcl-2 overexpression, which represents a main antiapoptotic factor in melanoma. This pronounced efficacy was related to BimL interaction with all antiapoptotic Bcl-2 family members in melanoma cells, as shown by co- immunoprecipitation analyses for Bcl-2, Bcl-xL, Mcl-1 and Bcl-w. Thus, BimL bears an extraordinary high proapoptotioc potential in melanoma cells, and strategies for its re- expression appear of particular interest. Such strategies have been reported with the B-Raf inhibitors, and their efficacy may be partly attributed to BimL re-expression. This identified specific role of these proapoptotic Bcl-2 proteins Bcl-xAK, Bcl-xS and BimL in apoptosis regulation of melanoma cells could be used for treatment of malignant melanoma to overcome the apoptosis resistance and to optimize the efficiency of current therapies. Thus, the identification of new proapoptotic domains may be finally employed for the development of small molecules, in analogy to BH3 mimetics.