dc.contributor.author
Kaulitz, Danny
dc.date.accessioned
2018-06-08T01:22:10Z
dc.date.available
2012-04-10T10:57:00.866Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/13293
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-17491
dc.description.abstract
Die porzinen endogenen Retroviren (PERVs) stellen für die Xenotransplantation
derzeit ein schwer einzuschätzendes Risiko dar. Sie besitzen die Fähigkeit, in
vitro humane Zelllinien zu infizieren und sich an diese zu adaptieren. Jedoch
konnte in ersten klinischen Xenotransplantationen sowie in verschiedenen
Tiermodellen bislang keine Übertragung von PERVs festgestellt werden. Ihr
pathogenes Potential ist weitestgehend unbekannt. Auf Grund ihrer
phylogenetischen Verwandtschaft zu pathogenen Retroviren sind Tumore,
neurologische Erkrankungen und Immunschwächen zu erwarten. Um eine Übertragung
zu verhindern, wurden verschiedene Strategien zur Minimierung des
Risikopotentials entwickelt. In der vorliegenden Arbeit wurde im ersten Teil
die Eignung der viralen Hüllproteine gp70 und p15E als Impfstoff zur Induktion
neutralisierender Antikörper gezeigt. Mit den rekombinanten Proteinen konnten
in fünf verschiedenen Spezies antigenspezifische Antikörper induziert werden.
Durch Epitopkartierungen wurde belegt, dass die immundominanten Bereiche der
induzierten p15E-Antikörper in der MPER und der FPPR lokalisiert sind und
Ähnlichkeiten zu Epitopen HIV-1-neutralisierender Antikörper aufweisen. In
einem Neutralisationsassay auf Basis der Bestimmung der Provirusintegration
mittels qRT-PCR konnten die PERV-neutralisierenden Eigenschaften von anti-p15E
und anti-gp70 Seren charakterisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde
die Inhibition der PERV-Expression in vivo und in vitro mittels RNA
Interferenz untersucht. Es wurden transgene Schweine mit PERV-spezifischer
shRNA (pol2) generiert und über einen Zeitraum von zwei Jahren beobachtet.
Trotz des Nachweises der shRNA Expression durch ein neues qRT-PCR basierendes
System konnten in PBMCs und Fibroblastenkulturen der Tiere keine Reduktion der
PERV-Expression im Vergleich zu den Kontrolltieren nachgewiesen werden. Neue
in vitro Daten sowie eine vergleichbare Studie belegen jedoch die
grundsätzliche Funktionalität der Methodik. Eine neue effektive shRNA-Sequenz
wurde identifiziert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden verschiedene PCR
basierte Techniken zur Identifizierung PERV-C-freier Tiere charakterisiert.
Zwar ist PERV-C nicht humantrop, doch geht von rekombinanten PERV-Stämmen aus
den Subtypen A und C eine besondere Gefahr aus. Da PERV-C im Gegensatz zu
PERV-A und PERV-B nicht in allen Schweinen vorkommt, sollten gemäß einer
Konsensus-Veröffentlichung der International Xenontransplantation Association
(IXA) für zukünftige Xenotransplantationen ausschließlich PERV-C-freie Tiere
verwendet werden. In der vorliegenden Arbeit wurden transgene und nicht-
transgene Hausschweine auf PERV-C-Proviren getestet und 35 von 38 Tieren als
positiv identifiziert. In einem Infektionsversuch wurden drei negativ
getestete Hausschweine mit einem hochtitrigen rekombinanten PERV-A/C-Stamm
inokuliert, wobei keine Replikation über einen Zeitraum von vier Monaten
nachgewiesen werden konnte. Bei der Analyse von 125 Wildschweinen wurde durch
Anpassung alter und durch Entwicklung neuer PCR-Setups ein neues bisher
unbeschriebenes PERV-C-Provirus entdeckt, das phylogenetische Verwandtschaft
zu einem im Bartschwein (Sus barbatus) gefundenen Provirus zeigt.
Interessanterweise wurden in keinem der Wildschweine enge Verwandte des
hausschweintypischen PERV-C gefunden.
de
dc.description.abstract
Porcine endogenous retroviruses (PERVs) are a hard calculable hamper for
xenotransplantation. They are able to adopt and to replicate in human cell
lines. However in first clinical xenotransplantations and in different animal
models transmission was not observed. The potential of pathogenicity of these
viruses is mostly unknown. Due to there phylogenetically relationship to other
pathogenic retroviruses, tumours, neurological and immunological disorders and
immunosuppression are most likely if xenosis occurs. Different strategies to
prevent artificial transmission during xenotransplantation are under
investigation. In the first part of this study the recombinant viral envelope
proteins gp70 and p15E are shown as potent inducers of neutralising antibodies
and promising candidates for an antiviral vaccine. Five model-species were
immunised and in all cases a strong humoral response was observed. The
epitopes of anti-p15E-antibodies were mapped and shown to be located within
the MPER and the FPPR of p15E which is comparable to epitopes of certain
HIV-1-neutralising antibodies. The PERV-neutralisation of anti-p15E and anti-
gp70 goat sera were characterised using a qRT-PCR based neutralisation assay.
The second part of this study focuses on RNAi mediated inhibition of PERV-
expression in vivo and in vitro. Transgenic pigs harbouring a PERV-shRNA
(pol2) were generated by SCNT and monitored over a period of two years. In
PBMCs and fibroblast cultures no significant reduction of PERV-expression in
reference to control-animals was diagnosable although transcription of the
shRNA was confirmed using an innovative qRT-PCR system. The general
feasibility of the method is shown with new in vitro data and in a comparison
to an other in vivo study. A new efficient shRNA-sequence was identified. In
the third part of this study different PCR-based techniques to identify
PERV-C-free pigs are characterised. Although PERV-C is not humantrop,
recombinants of PERV-C and PERV-A are of special concern in
xenotransplantation. Unlike PERV-A and PERV-B, PERV-C is not present in all
pigs. In reference to the consensus statement of the International
Xenotransplantation Association (IXA) only PERV-C-free pigs should by used for
future xenotransplantations. In this study transgenic and none-transgenic pigs
were tested for the presence of PERV-C-proviruses. 35 of 38 animals were
identified as positive. In an infection experiment three negative pigs were
inoculated with a high titre recombinant PERV-A/C and no replication was
observed over a period of four months. Additionally PERV-C-prevalence in 125
wild boars was analysed and a currently unpublished PERV-C-provirus was found
through adaption and development of old and new PCR-setups. The new provirus
is related an A/C-provirus found in bearded pigs (Sus barbatus).
Interestingly, no relative of the common PERV-C-virus was found in wild boars.
en
dc.format.extent
XIV, 123, XX Bl.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
Xenotransplantation
dc.subject
Neutralisierende Antikörper
dc.subject
neutralising antibodies
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit::618 Experimentelle Medizin
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::576 Genetik und Evolution
dc.title
PERV und Xenotransplantation
dc.contributor.contact
KaulitzD@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. R. Kurth
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. R. Mutzel
dc.date.accepted
2012-03-22
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000036614-4
dc.title.subtitle
Impfstoffe, RNAi und genotypische Selektion
dc.title.translated
PERV and Xenotransplantation
en
dc.title.translatedsubtitle
Vaccines, RNAi and genotyping
en
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000036614
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000010870
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access