Die Wirkung von Simvastatin allein und in Kombination mit Daptomycin auf L6-Zellen in vitro

Abstract

Statine inhibieren die Cholesterolbiosynthese und sind die Medikamentengruppe der ersten Wahl für die Behandlung einer Hypercholesterinämie. Fallberichte suggerieren eine verstärkte Muskelschädigung durch eine Kombination von Statinen mit dem Antibiotikum Daptomycin, welches bei Infektionen durch grampositive Erreger, einschließlich MRSA und VRE, eingesetzt wird. Bislang existieren kaum Daten bezüglich einer gemeinsamen Wirkung von Statinen und Daptomycin auf das Muskelgewebe. In der vorliegenden In-vitro-Arbeit wurde daher modellhaft die alleinige und kombinierte Wirkung von Simvastatin und Daptomycin auf die Zellmorphologie, die Expression intrazellulärer Proteine und die Apoptose/Nekrose von murinen L6-Myozyten und auf die Proliferation von L6-Myoblasten analysiert. Lichtmikroskopische Untersuchungen der L6-Myozyten mit Bisbenzimid H33258 und Propidiumiodid zeigten nach 72-stündiger Exposition gegenüber 10 µM Simvastatin (ca. 4,2 mg/l Medium) und/oder 300 mg Daptomycin/l Medium einen Verlust der Zelladhärenz und eine Karyo und Zytolyse. Die Ergebnisse wiesen auf einen toxischen Effekt von Simvastatin und Daptomycin allein und auf eine verstärkte Zytotoxizität durch die Kombination beider Substanzen hin. Die zellschädigende Wirkung von Simvastatin und Daptomycin wurde durchflusszytometrisch mit Annexin V-FITC und Propidiumiodid-Färbung und im MTT-Zytotoxizitätstest bestätigt und konnte zusammenfassend als zeit- und konzentrationsabhängig charakterisiert werden. Eine Zytotoxizität wurde nach zehntägiger Exposition für therapeutische Konzentrationen beider Substanzen gezeigt. Ein additiver bis synergistischer Effekt mit Simvastatin bestand erst in einer supratherapeutischen Dosierung von 300 mg Daptomycin/l Medium. Ein Anstieg der Caspase 3 in L6-Myozyten wurde immunhistochemisch nach 24 stündiger Exposition mit Simvastatin und/oder Daptomycin in keiner Versuchsreihe nachgewiesen. Simvastatin führte aber ab einer Konzentration von 1 µM nach 24 stündiger Exposition zu einer reduzierten Expression des kleinen G-Proteins Rho und des Zytoskelettproteins Vimentin in L6-Myozyten. Dies suggeriert übereinstimmend mit In-vitro-Arbeiten weiterer Autoren eine Dysprenylierung und eine Veränderung des Zytoskeletts als pathophysiologische Elemente der Muskelschädigung. Daptomycin allein und in Kombination mit Simvastatin hatte keine (zusätzliche) Wirkung. Dies könnte auf einen alternativen Mechanismus der Muskelschädigung durch Daptomycin hinweisen. Für L6-Myoblasten wurde eine Proliferationshemmung durch 10 µM Simvastatin durchflusszytometrisch mit CFSE-Färbung identifiziert. Daptomycin in einer maximalen Konzentration von 300 mg/l Medium zeigte keine antiproliferative Wirkung und keinen adjuvanten Effekt in Kombination mit Simvastatin. Zusammenfassend wurde in dieser In-vitro-Arbeit ein zytotoxischer Effekt für Simvastatin und Daptomycin allein und eine additive bis synergistische Zytotoxizität für die Kombination beider Substanzen identifiziert. Letztere bestand für Kombinationen mit Daptomycin in supratherapeutischen Dosierungen. Die Arbeit lieferte Hinweise darauf, dass der Zellschädigung jeweils unterschiedliche Mechanismen zugrundeliegen. Ein weitergehendes Verständnis der pathophysiologischen Zusammenhänge der Muskelschädigung könnte dazu beitragen, das Risikoprofil besser zu charakterisieren und Ansatzpunkte für eine ursächliche Therapie zu identifizieren.

Statins inhibit the endogenous cholesterol synthesis and are the first-line treatment for hypercholesterolaemia. Case reports suggest an enhanced myotoxicity of statins in combination with daptomycin, an antibiotic used for the treatment of gram-positive bacteria including MRSA and VRE. Data regarding the combined effects of statins and daptomycin on muscle cells are rare. This in vitro study examined the sole and common effect of simvastatin and daptomycin on cell morphology, intracellular protein expression, apoptosis/necrosis and proliferation of murine L6 myoblasts or myocytes respectively. Microscopic analysis with bisbenzimide H33258 and propidiumiodide after 72 h of exposure with 10 µM simvastatin (= 4.2 mg/l) and/or 300 mg daptomycin/l medium revealed loss of cell adherence and karyo- and cytolysis of L6 myocytes. The results indicated a cytotoxicity of simvastatin and daptomycin alone, which was augmented by combination of both substances. Flow cytometry analysis with Annexin V-FITC and propidiumiodide and MTT assay confirmed a concentration- and time-dependant cytotoxicity of both agents. After 10 days of exposure therapeutic concentrations of each substance elicited a cytopathic effect. An additive or mildly synergistic effect in combination with simvastatin was identified at supratherapeutic doses of 300 mg daptomycin/l medium. Caspase 3 elevation was not detected with immunohistochemical staining after 24 h of incubation with simvastatin and/or daptomycin. However, simvastatin at a minimal concentration of 1 µM reduced the expression of the small g-protein Rho and the cytoskeletal protein vimentin. Consistent with other in vitro studies, these results suggest dysprenylation and cytoskeletal disruption as pathogenetic elements of simvastatin muscletoxicity. Daptomycin alone or combined with simvasatin showed no (additional) effect, implying that daptomycin may elicit a different pathomechanism. In L6 myoblasts, simvastatin at a concentration of 10 µM impaired proliferation after 24 h of exposure. Daptomycin alone did not exert an antiproliferative effect and had no additional influence in combination with simvastatin. In summary, a cytotoxic effect of simvastatin and daptomycin alone and an additive or mildly synergistic cytotoxicity by combination of both substances were identified. Augmented toxicity was demonstrated for combinations of simvastatin at therapeutic concentrations and daptomycin at dosages above the therapeutic range. This study implicated different underlying pathomechanisms of myopathy for simvastatin and daptomycin. Further understanding of the pathophysiologic mechanisms may improve risk evaluation and help to establish a therapeutic approach for the treatment of medication- induced myopathy.