Einfluß von Keratinmutationen (KRT8/18) auf den Verlauf bzw. Schweregrad der Lebererkrankung bei chronischer Hepatitis C-Virusinfektion und hereditärer Hämochromatose: Untersuchung von KRT8/18 unter optimierten DHPLC-Analysebedingungen in deutschen und österreichischen Populationen

Abstract

Keratin 8 und 18 schützen die Leber gegenüber mechanischen und nicht mechanischen Formen von Belastung und KRT8/18-Varianten können das Risiko von Leberzirrhose erhöhen. Bei 256 deutschen Leberpatienten wurden keine aminosäuresubstituierenden KRT8/18-Mutationen gefunden. Bei 12,4% US- amerikanischer Patienten wurden K8/18-Mutationen detektiert und als Risikofaktoren für terminale Lebererkrankung unterschiedlicher Ätiologie identifiziert. Es ist unklar, ob spezifische Leberkrankheiten präferentiell betroffen sind. Beide Studien verwendeten die DHPLC zur Variantendetektion. Experimentelle Bedingungen könnten zu der Diskrepanz der Studienergebnisse beigetragen haben. Im ersten Schritt wurde daher die DHPLC-Analyse anhand von sequenzierten Kontrollvarianten für die wichtigsten zehn KRT8/18-Exone unter einem Spektrum von Schmelztemperaturen optimiert. 6/16 getestete Varianten in 3/10 Exonen konnten bei software-prognostizierten Temperaturen nicht zuverlässig detektiert werden einschließlich K8 G62C, I63V und R341H. Alle Varianten waren jedoch bei Zusatz von 2°C höheren Schmelztemperaturen eindeutig zu identifizieren. Die Re-Analyse von K8 Exon 1 und 6 von 151 der 256 deutschen Leberpatienten deckte zusätzlich 12 exonische und 2 intronische heterozygote K8-Varianten auf: eine K8 G62C, zwei K8 I63V, sieben K8 R341H, eine K8 E376E und K8 V380I, sowie zwei intronische KRT8 1202+46 A→T. Die DHPLC-Sensitivität ist entscheidend von den DNA-Schmelztemperaturen abhängig. Im nächsten Schritt identifizierten wir bei 329 deutschen Patienten mit chronischer Hepatitis C-Virusinfektion nach Analyse aller K8/18-Exone heterozygote aminosäuresubstituierende Varianten bei 24 (7,3%) und nicht kodierende Varianten bei 26 (7,8%) Patienten. Darunter waren 3 neue K8-Varianten (T26R, G55A, A359T), 6 neue nicht kodierende Varianten und eine K18 S230T-Variante bei 2 Patienten. Am häufigsten waren K8 R341H bei 10 (3%), K8 G62C bei 6 (1,8%) und K8 I63V bei 4 (1,2%) Patienten. Erstmals zeigten wir eine ausschließliche und exklusive Kombination der intronischen KRT8 IVS7+10delC- und exonischen K8 R341H-Mutation bei allen 10 Patienten mit möglicher kausaler Beziehung. Als wichtigstes Ergebnis wurden kodierende exonische K8/18-Mutationen als signifikanter Risikofaktor für die Entwicklung schwerer Leberfibrose/-zirrhose bei CHC identifiziert: OR = 8,74; 95%-KI = 2,63-29,07; p <0,001. Eine andere Studie fand K8 R341H-Mutationen bei 7,6% HFE C282Y-homozygoten amerikanischen Hämochromatosepatienten vs. 0% in Kontrollen. In abschließender Untersuchung detektierten wir heterozygote aminosäuresubstituierende K8-Varianten bei 10/162 (6,2%) HFE C282Y-homozygoten österreichischen Patienten. Darunter waren bislang unbekannte K8 Q169E- und R275W-Varianten mit potentiell biologischen Auswirkungen. Unter zehn identifizierten nicht kodierenden KRT8-Varianten waren zwei bisher unbekannt. Am häufigsten waren K8 R341H bei 4 und G62C bei 3 Patienten. Die ausschließliche Kombination von K8 R341H plus KRT8 IVS7+10delC wurde bei allen 4 Patienten bestätigt. Eine signifikante Assoziation von kodierenden (p = 0,78) oder nicht kodierenden (p = 0,09) KRT8/18-Varianten mit Leberzirrhose bei HFE C282Y-homozygoter Hämochromatose wurde nicht beobachtet mit eingeschränkter statistischer Aussagekraft der Ergebnisse aufgrund des begrenzten Kohortenumfangs.

Keratin 8 and 18 (K8/K18) protect the liver from various forms of injury and K8/K18 mutations confer a risk to development of end-stage liver diseases. In 256 German liver disease patients no amino acid altering K8/K18 mutations were detected. In contrast, K8/18 mutations occurred in 12.4% of a U.S. patient cohort and potentially promote development of end-stage liver diseases. It is unknown if specific liver diseases are preferentially involved. Both studies employed denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) for variant detection. Experimental conditions might have contributed to discrepancy of results. Thus, DHPLC analysis was refined using known sequenced variants located in ten most relevant KRT8 and KRT18 exons. Six out of 16 variants in three exons were not reliably detected, including K8 G62C, I63V and R341H, using software-generated melting temperatures. All variants were identified by addition of 2°C increased temperatures. Re-analysis of K8 exon 1 and exon 6 in 151 of 256 German liver disease patients revealed 12 exonic and 2 intronic heterozygous K8 variants: one K8 G62C, two K8 I63V, seven K8 R341H, one K8 E376E and a novel K8 V380I and two intronic KRT8 1202+46 A→T. Accurate melting temperatures are pivotal for DHPLC sensitivity. Using refined DHPLC, we analysed KRT8/18 coding sequences completely in 329 German patients suffering from chronic hepatitis C infection and identified heterozygous amino acid altering variants in 24 (7.3%) and non coding variants in 26 (7.8%) patients. 3 novel K8 variants (T26R, G55A, A359T), 6 novel non coding variants and a single K18 S230T variant were detected. Most frequent variants were K8 R341H in 10 (3%), K8 G62C in 6 (1,8%) and K8 I63V in 4 (1,2%) patients. A novel and exclusive association of an intronic KRT8 IVS7+10delC-deletion in all 10 patients with K8 R341H was observed suggesting a causal relationship. Notably, there was a significant association of exonic K8/18 variants with advanced fibrosis and cirrhosis: OR = 8,74; 95%-KI = 2,63-29,07; p <0,001. Another study described K8 R341H in 7.6% of HFE C282Y homozygous U.S. patients with hereditary hemochromatosis vs. none in controls. We identified five heterozygous amino acid altering K8 variants in 10/162 (6.2%) HFE C282Y homozygous patients from Austria including novel and conserved K8 Q169E and K8 R275W substitutions. Upon 10 identified non coding variants, two were newly described. Most common alterations were K8 R341H and K8 G62C in 4 and 3 patients. The unique segregation of the most common K8 R341H with intronic KRT8 IVS7+10delC-deletion was observed in all 4 patients. There was no significant association neither of exonic nor intronic K8 variants and development of cirrhosis in patients with hereditary hemochromatosis. However, statistical analysis was hampered by limited patient cohort and incomplete clinical documentation. Further investigations are warrant to elucidate the relevance of K8/18 variants in HFE C282Y homozygous hereditary hemochromatosis.