Matrixgebundene topologisch fixierte DNA

Abstract

Zusammenfassung

Der topologische Zustand von DNA ist eines ihrer wesentlichen Merkmale und beeinflußt sowohl den informatorischen Gehalt einzelner Sequenzen auf dem Niveau der Interaktion zwischen diskreten, kurzen Basenfolgen und daran bindenden Liganden, als auch die Zugänglichkeit ganzer Chromosomenabschnitte. Im Zellkern liegt DNA topologisch fixiert vor, die Fixierung kann dabei in Abhängigkeit von ihrer morphologischen oder funktionellen Charakterisierung unterschiedlich definiert sein.

Torsionsspannung als Bestandteil der physiologischen Eigenschaften wird erst durch topologische Fixierung der DNA, meist an einer Matrix, möglich. Die Modulation des Gehaltes an Torsionsspannung, und damit an Konformationsenergie, hat Auswirkungen auf zahlreiche Aspekte der DNA im Zellkern, u.a. die Fähigkeit zur Initiation der Transkription und die Ausbildung von alternativen Sekundärstrukturen, wie Z-DNA.

In meiner Arbeit wird ein Modell vorgestellt, welches die Untersuchung von matrixgebundener, topologisch fixierter DNA durch Bindung kovalent geschlossener, linearer Moleküle an eine Oberfläche ermöglicht.

Das System wurde umfangreich durch Bindungsexperimente mit Sekundärform- spezifischen Antikörpern charakterisiert. Die Bildung von Z-DNA bei viel geringeren Unterwindungsgraden als im Plasmidsystem wird gezeigt. Die Bindungsspezifität der bindenden Antikörper sowie der Z-DNA-bindenden Domäne des RNA ediernden Enzyms dsRAD1 wurde untersucht.

Das System eignet sich zur Untersuchung der Wirkung und Inhibition von Topoisomerasen. Beispiele für Experimente mit Topoisomerasen sowie die Bildung von RNA-Schleifen als Konsequenz der Transkription in gespannter DNA werden gezeigt.

Summary

The topological state of DNA is one of the defining aspects of this molecule. It has consequences for its informatoric content both on the level of single sequence:ligand interactions and the accessibility of entire chromosomal sections at large. Physiologically, DNA is topologically fixed, the nature of the fixation usually being defined by its morphological or functional characterization.

Topological fixation, by attachment to the nuclear matrix in eucaryotic cells, is a prerequisite of the modulation of torsional strain in DNA. This modulation is eqivalent to a tuning of the conformational energy of the molecule. This conformational energy has ramifications for many aspects of DNA, among them the initiation of transcription and the formation of alternative secondary structures, such as Z-DNA.

A model is presented here that allows experimentation on matrix-attached, topologically fixed DNA by binding linear, covalently closed DNA molecules to a surface.

The system was characterized exhaustively using binding experiments with antibodies specific for secondary structures of DNA. The formation of Z-DNA at specific superhelical densities much lower than previously reported for the plasmid system is demonstrated. Binding specificities of different antibody preparations and the Z-DNA-binding domain of the RNA editing enzyme dsRAD1 were determined.

We show that the system is able to discriminate the activity and inhibition of different topoisomerases. The formation of RNA-loops as a consequence of transcription in torsionally strained DNA is also demonstrated.