Homo- und Heterophile Oligomerisierung von APP, APLP1 und APLP2: Charakterisierung von Kontaktstellen und Cis- und Transinteraktionen

Abstract

Die Homo- und Heterodimerisierung der APP-Protein-Familie sowie der Einfluss heterophiler Interaktionen auf die Prozessierung des APP und die Funktionen der Protein-Familie sind bisher wenig verstanden. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit die Homodimerisierung der APLPs und die Heterodimerisierung der APP-Protein-Familie charakterisiert werden. Mit in vitro Studien rekombinant hergestellter Proteine konnte erstmals eine Oligomerisierung (Dimere, Tetramere, höhere Oligomere) der APP-homologen Proteine APLP1 und APLP2 gezeigt werden. Des Weiteren konnte die Dimerisierung des APP charakterisiert werden und führte zu folgenden Resultaten. (1) Der N-Terminus (Aminosäuren 18-350) ist ausreichend um die Dimerisierung des APP zu vermitteln. (2) Die Dimerisierung lässt sich durch ein Peptid, welches den Loop (Cys 98 und 105) darstellt, teilweise inhibieren. (3) Das Loop -Peptid beeinflusst massiv die Prozessierung von APP und verringert die Entstehung von Aß. (4) Das Loop -Peptid führt zu mit NMR detektierbaren Konformationsänderungen, die besonders konservierte hydrophobe Aminosäuren betreffen. Basierend auf diesen Daten konnte ein Modell der Homodimerisierung des APP-N-Terminus erstellt werden. Demnach wird die Homodimerisierung von APP durch den Loop vermittelt und durch hydrophobe Aminosäuren benachbarter Domänen stabilsiert. Diese Daten sind beim Journal of Biological Chemistry zur Veröffentlichung eingereicht und unter Revision. In umfangreichen Lebend-Zell-Analysen wurde im Rahmen dieser Arbeit die Lokalisation und Homo- und Heterodimerisierung der Proteine der APP-Familie charakterisiert. Hinsichtlich der subzellulären Lokalisation unterschied sich APLP1 sehr deutlich von den beiden anderen Familienmitgliedern. (1) APLP1 war fast ausschließlich an der Zelloberfläche lokalisiert. (2) APP und APLP2 fanden sich hingegen hauptsächlich in intrazellulären Kompartimenten und wenig an der Zelloberfläche. (3) Die Lokalisation von APLP1 konnte durch die Koexpression mit APP oder APLP2 beeinflusst werden und führte zu einer Retention von APLP1. Mittels FRET und Koimmunpräzipitationen konnte für alle drei Proteine der humanen APP-Familie sowohl die Homo- als auch die Heterodimerisierung in lebenden HEK293-Zellen nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind teilweise im EMBO Journal veröffentlicht (Munter et al., 2007). Durch Analysen von N-terminalen Deletionsmutanten konnten die bisherigen Modelle zur Interaktion erheblich erweitert werden. Durch die FRET-Analysen kristallisierten sich zudem deutliche Unterschiede zwischen APLP1 und APP/APLP2 heraus. (1) Die APLP1- Loop -Region ist nicht entscheidend an der Homo- und Heterodimerisierung von APLP1 beteiligt. (2) In APP und APLP2 hingegen ist die Loop -Domäne für die Homo- und Heterodimerisierung essentiell. (3) Die Dimerisierung der Proteine der APP-Familie erfolgt von Kopf-zu-Kopf . Diese Ergebnisse führten zu einem Kopf-zu-Kopf -Modell der Homo- und Heterodimerisierung der Volllängenproteine. Im Rahmen dieser Arbeit konnte mit Zink erstmals ein extrazellulärer Effektor identifiziert werden, welcher Interaktionen zwischen den Proteinen und die Lokalisation der APP-Protein- Familie erheblich beeinflusst. Daraus ergaben sich die folgenden Ergebnisse. (1) Unabhängig von extrazellulären Effektoren konnten in HEK293-Zellen nur für APLP1 Zell-Zell-Kontakte beobachtet werden. (2) Zink führte in APLP1- und APLP2- exprimierenden Zellen zur Ausbildung von Clustern in der Plasmamembran, die eine Verstärkung bestehender Cisinteraktion hervorrief. (3) Für die Erhöhung der Cis-Dimerisierung von APLP1 durch Zink konnte ein EC50 von 2,5 μM bestimmt werden. (4) Zink konnte sowohl eine Verstärkung bestehender Transinteraktionen (APLP1) als auch die Vermittlung von Transinteraktionen (APLP1 und APLP2) auslösen. Basierend auf diesen Daten und dem Modell der Homo- und Heterodimerisierung konnten hypothetische Mechanismen für die Zink-vermittelte Cis- und Trans-Dimerisierung abgeleitet werden. Demnach können die Dimere durch Zink ein strukturelles Netzwerk ausbilden. Die Zinkabhängigkeit von Zell-Zell-Kontakten und der Einfluss auf die Cis- Dimerisierung eröffnen neue Perspektiven für die funktionelle Charakterisierung der APP-Protein-Familie.

Homo- and heterodimerization of the APP protein family as well as the influence of heterophilic interactions on processing and function of APP are still under debate. Therefore the aim of this work was to characterize homodimerization of APLPs and heterodimerization of the APP protein family. We therefore performed in vitro studies with recombinant proteins. For the first time we demonstrated the presence of oligomers (dimers, tetramers, higher oligomers) for the APP homologous proteins APLP1 and APLP2. Furthermore, we characterized the dimerization of APP with the following results. (1) The N-terminus (amino acids 18-350) is sufficient to mediate APP dimerization. (2) Dimerization is partially inhibited by a peptide that mimics a surface exposed loop between Cys 98 and 105 of APP. (3) The loop peptide dramatically influences the processing of APP and decreases Aß production. (4) The loop peptide causes NMR-detectable structural changes in conserved hydrophobic regions. Based on this data, we proposed a model for the homodimerization of the APP N terminus. Thus, we suggest that APP acquires a loop-mediated homodimeric state, which is further stabilized by interactions of hydrophobic residues of neighboring domains. This data has been submitted to Journal of Biological Chemistry and the manuscript is under revision. In living cells we characterized the localization and homo- and heterodimerization of the APP- family proteins. Concerning the subcellular distribution, APLP1 markedly differs from the other family members. (1) APLP1 was almost exclusively located at the cell surface. (2) APP and APLP2 were mainly found in intracellular compartments and showed only a weak plasma membrane staining. (3) Subcellular distribution of APLP1 was influenced by APP and APLP2 and led to retention of APLP1 in intracellular compartments. The homo- and heterodimerization of the APP-family members was determined in living HEK293 cells by FRET and coimmunoprecipitations. Parts of these results have been published in the EMBO Journal (Munter et al. 2007). Based on the analyses of N-terminal deletion mutants we could elaborate more advanced versions of existing models. Additionally, the FRET studies revealed distinct mechanisms of dimerization for APLP1 and APP/APLP2. (1) The loop region of APLP1 is not essential for homo- and heterophilic interactions of APLP1. (2) However, in APP and APLP2 the loop domain is crucial for mediating homo- and heterodimerization. (3) Dimerization occurs in a head-to-head arrangement. Based on these results we propose a head-to-head-model for the homo- and heterophilic dimerization of the full-length proteins. For the first time, we have identified zinc ions as extracellular ligands of APLP1 and APLP2 that substantially influence the localization as well as the interactions of the APP-family proteins. We obtained the following results. (1) Only APLP1 was determined in cell-cell contacts independently of extracellular ligands. (2) Zinc induced clustering of APLP1 and APLP2 in the plasma membrane, accompanied by increasing FRET efficiencies, indicating enhanced cis interactions. (3) We measured an EC50 of 2.5 μM for the zinc-mediated increase of APLP1 cis interactions. (4) Zinc also modulated trans interactions and led to an enhancement of already existing cell-cell contacts (APLP1) and induced the formation of novel cell-cell contacts (APLP1 und APLP2). Based on this data and the model for homo- and heterodimerization a hypothesis for the mechanism of the zinc-mediated cis and trans dimerization could be that the dimers are linked to a structural network in cis or trans position. The zinc-dependent generation of cell-cell contacts and its influence on cis dimerization opens up new perspectives for the functional characterization of the APP family proteins.