Untersuchungen zur DNA-Methylierung des hypothalamischen POMC-Promotors bei neonatal überernährten Ratten

Abstract

Einführung: Neonatale Überernährung führt bei Ratten, die in kleinen Würfen aufgezogen werden, zu lebenslanger Adipositas sowie zu einer Fehlregulation von Neuropeptiden im Hypothalamus, die zentral Nahrungsaufnahme und Energiestoffwechsel regulieren. Die Auswirkungen neonataler Einflüsse auf den Phänotyp und die Funktionsweise des Organismus inklusive der resultierenden Krankheitsdispositionen werden als perinatale Programmierung bezeichnet. Ein epigenetischer Mechanismus, welcher perinatalen Programmierungsprozessen zugrunde liegen könnte, ist die CpG-Methylierung von Genpromotoren. Proopiomelanocortin (POMC) ist das bedeutendste anorexigene Neuropeptid im Hypothalamus ist. Der POMC-Promotor ist als CpG-reich und methylierungssensitiv beschrieben worden. Ziel dieser Studie war es, im hypothalamischen POMC-Promotor epigenetische Veränderungen zu finden, die zu einer lebenslangen Fehlregulation des Gens führen könnten. Methodik: Entsprechend dem Tiermodell der kleinen Würfe wurde bei Ratten eine neonatale Überernährung erzeugt. Am 21. Lebenstag erfolgte die Dekapitation zur Blutgewinnung und Gehirnentnahme. Die hypothalamische POMC-Expression wurde mit der Methode der semiquantitativen RT-PCR bestimmt. Die Methylierungsanalyse beruhte auf der Methode der Natriumbisulfitbehandlung der DNA mit nachfolgender Klonierung und abschließender Sequenzierungs-PCR. Ergebnisse: Ratten aus kleinen Würfen waren am 21. Lebenstag übergewichtig und zeigten im Blut erhöhte Konzentrationen von Glukose, Insulin und Leptin sowie eine deutlich erhöhte Insulin-Glukose-Ratio als Maß der Insulinresistenz. Es ließ sich kein Unterschied feststellen im Gesamtgehalt an CpG-Methylierungen des POMC-Promotors. Er machte in beiden Gruppen im Mittel 12 Prozent aus. Innerhalb der Bindungsstellen der aktivierenden Transkriptionsfaktoren Nf-κB und Sp1 fand sich ein signifikant erhöhter Methylierungsanteil im POMC- Promotor neonatal überernährter Ratten. Im Gegensatz dazu stellte sich in der Versuchsgruppe die Bindungsstelle des transkriptionshemmenden Glukokortikoidrezeptors als tendenziell hypomethyliert dar. Im Hypothalamus neonatal überernährter Ratten war die Expression von POMC nicht erhöht. Wurde die POMC- mRNA durch Quotientenbildung in Bezug zu Insulin bzw. Leptin gesetzt, so zeigten sich diese relative POMC- Expression als signifikant erniedrigt bei neonatal überernährten Tieren. Darüber hinaus korrelierten die CpG-Methylierungen innerhalb der Bindungsstellen von Nf-κB und Sp1 signifikant negativ mit der insulinabhängigen POMC-mRNA-Expression. Ein weiterer Zusammenhang erschloss sich zwischen der CpG-Methylierung des POMC-Promotors sowie den Bindungsstellen von Nf-κB und Sp1 und der Blutglukose, welche signifikant positiv miteinander korrelierten. Zusammenfassung: Die vorliegende Studie präsentiert zusammengenommen erstmals das Methylierungsmuster des POMC- Promotors im Hypothalamus gesunder sowie übergewichtiger Ratten und gibt deutliche Hinweise auf eine epigenetische Programmierung des Neuropeptids durch neonatale Überernährung und Hyperglykämie. Die Bedeutung einer Prävention von Gestationsdiabetes und Überernährung in der Säuglingszeit ist herauszustellen.

Introduction: Environmental alterations during critical periods of early development have fundamental impact on the lifelong disease susceptibility of the organism. For example, intrauterine hyperglycemia or rapid neonatal weight gain increase the risk of obesity und associated chronic diseases in adulthood. The most common epigenetic mechanism of these perinatal programming processes is the CpG-methylation of genes, which lead to permanent alterations in gene expression. It was postulated that neonatal overfeeding may alter DNA methylation pattern of the main anorectic neuropeptide in the hypothalamus proopiomelanocortin (POMC) and may cause permanent hyperphagia and metabolic disorders seen in these rats. Methods: Neonatal overfeeding was induced by rearing Wistar rats in small litters (SL). Using bisulfite sequencing DNA methylation status of the hypothalamic POMC gene promoter was mapped. POMC- mRNA-expression was measured by semiquantative RT-PCR. Results: Neonatal overfeeding led to rapid early weight gain, resulting in a metabolic syndrome phenotype: SL-rats presented obesity, hyperleptinemia, hyperglycemia, hyperinsulinemia, and an increased insulin/glucose ratio. In SL rats the hypothalamic gene promoter of the POMC showed hypermethylation of CpG dinucleotides within the binding sequences of transcription factors Sp1 and NF-kappaB. POMC expression lacked upregulation; moreover insulin- and leptin- related POMC-mRNA was significantly reduced in SL rats. DNA methylation within the Sp1 and NF-kappaB binding sequences was inversely correlated to the quotients of POMC expression/leptin and POMC expression/insulin. Glucose levels found to be significantly positively correlated to the CpG methylation of the POMC gene promoter and the binding sites of Sp1 and NF-kappaB. Conclusion: This is the first study to demonstrate binding-site specific epigenetic programming of hypothalamic POMC gene promoter by neonatal overfeeding in rats. Functional relevance of increased site-specific DNA methylation in SL rats was shown by lack of stimulation of POMC gene expression and inverse correlations. These findings reveal the neonatal period as critical for nutritional programming of a neuropeptide. Overfeeding and hyperglycemia seem to be epigenetic risk factors of obesity programming and consecutive metabolic syndrome.