Development of a tert-butyl thiol linker for the synthesis of peptide thioesters and thioacids for application in chemical ligation methods

Abstract

The aim of this research project was to apply a base-stable tert-butyl thiol linker for the Fmoc SPPS based synthesis of peptide thioesters and thioacids to be used in chemical ligation reactions. The first part of this dissertation was to develop a base-stable linker which would provide the means to synthesize peptide thioesters. The second part of this work was concerned with applying this linker strategy for the synthesis of peptide thioacids. Finally, the newly rediscovered ligation reaction between thioacids and azides was reinvestigated with the addition of metal salts. Thioesters are generally known to be base labile, which has previously limited their use as linkers in Fmoc-based SPPS. Tert-butyl thioesters, however, are special and distinct from from other thioesters: While being stable under under alkaline conditions they are easily cleaved under only slightly basic conditions by primary thiolates. In stability experiments, we have shown that Boc-Phe-S-t-butyl has a half life of 6.5 days when treated with 20 % piperidine in DMF being 28 times more stable than Boc-Phe-S-ethyl (half life of 5.5 hours). Accordingly, a tert- butyl linker attached to an acid sensitive resin might allow a direct synthesis access to peptide thioesters. We developed 4-mercapto 4-methylpentanol (MMP) as a tert-butyl thiol linker which was coupled to a standard 2-Cl-tritylchloride resin via its hydroxyl function. Acylation of the tert-butyl thiol with the first amino acid was accomplished using either Fmoc- Amino acid fluorides or the condensation reagent combination EDC/DMAP with yields ranging from 70-90 %. For most dipeptides tested, no diketopiperazine (DKP) formation was observed after coupling of the 2nd amino acid. DKP formation which resulted only in relatively low yield loss, could be fully avoided by quantitative coupling of dipeptides to the first resin bound amino acid using HATU/HOAt. After standard Fmoc-SPPS synthesis, the bound peptide thioesters could be cleaved either with acid to yield fully deprotected or by nucleophilic displacement with thiolate to furnish fully protected peptide thioesters. The yields and puritiesof the synthesized peptide thioesters were good ranging from 50-90 % and could be used directly in further in the Native Chemical Ligation (NCL). As a final test of the robustness of the linker, a 16mer derivative of the cell-penetrating peptide, Penetratin 1, was synthesized using the MMP linker and after acidic cleavage obtained in a 67 % yield after HPLC purification. In the second part of this dissertation, the synthesis of peptide thioacids was investigated using the MMP linker. By displacing the peptide from the resin with ß-eliminable 2-mercaptopropionitrile followed by base treatment, the method was extended to the preparation of peptide thioacids. The thiol is easily obtained from the commercially available disulfide under reducing conditions. Accordingly, an in-situ generated pentapeptide thioacid could be transformed via addition of tosyl azide to the corresponding sulfonamide. As a result of this, sulfonamides could be prepared from thioester peptides in a two-step one pot reaction. The final part of this dissertation was concerned with optimizing the ligation reaction between thioacids and electron-rich azides. It has been shown by the group of Williams, that electron deficient azides react rapidly with thioacids under basic conditions to yield sulfonamides in good yields. To date, slightly more electron rich azides, such as peptidyl azides have not found utility in this method due to their lower reactivity. This has left room for improvement since the application of peptide thioacids would be a considerable achievement for this ligation reaction. The initial investigation was concerned with the effect that metal salts would have on increasing the reaction rate between the thioacids and azides. Surprisingly, upon addition of copper (I) and silver (I) salts, formation of a thioamide product was observed. This reaction was found to occur under a catalytic amount of the metal salt and to be compatible under aqueous conditions. Shifting the electronic nature of the thioacid as well as the azide shifted to a slight loss in chemoselectivity. Nevertheless, Fmoc-Phe-SH was reacted with α-azidoglycine methylester to give a thioamide to amide relationship of 1.6 : 1. This proved to be a promising initial result for a new chemical transformation between thioacids and azides.

Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines basenstabilen tert-butyl Linkers für die Fmoc-Festphasenpeptidsynthese von Peptidthioestern und Peptidthiosäuren. Auf diese Weise hergestellten Peptide wurden dann weiter verwendet in unterschiedlichen Ligationsreaktionen. Der erste Teil dieses Projektes beschäftigt sich mit der Entwicklung eines basenstabilen Linkers für die Synthese von Peptidthioestern. Der zweite Teil der Arbeit widmete sich der Anwendung dieser Linkerkonzeptes auf die Synthese von Peptidthiosäuren und ihren Einsatz für die Thiosäure/Azid-Ligationsreaktion. Im letzten Teil dieser Arbeit, wurde die Bedeutung von Metalsalzen in der Thiosäure/Azid-Ligation eingehend untersucht. Auf Grund der Basenlabilität von Thioestern sind bislang wenige Synthesemethoden bekannt, die mit der Fmoc-SPPS kompatibel sind. Tert- butyl Thioester unterscheiden sich grundlegend von anderen Alkyl- und Arylthioestern hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Säuren sowie auch Basen. Trotz dieser erhöhten Stabilität lassen sich Tert-butyl-Thioester einfach mit primären Thiolaten abspalten. Mit einer Halbwertszeit von 6,5 Tagen ist der Boc-Phe-S-t-butylester gegenüber 20 % Piperidin in DMF 28mal stabiler als der entsprechende Boc-Phe-S-ethylester mit 5,5 Stunden. Es wurde festgestellt, dass auf Grund dieser Ergbnisse ein tert-butyl-Linker sehr gut geeignet ist für die Synthese von Peptidthioestern. Als bester tert-butyl- Thiolinker hat sich 4-Mercapto-4-Methylpentanol (MMP) erwiesen. Nach der Kupplung dieser Linkers auf ein säurenlabilen 2-Cl-Tritylchlorid-Harz, erfolgte die Acylierung mit der ersten Aminosäure. Im Acylierungschritt wurden sowohl mit EDC/DMAP als auch mit Fmoc-Aminosäurefluoriden bis zu 90 % Ausbeute erreicht. Bei der Entschützung der zweiten Aminosäure wurde für den Großteil der untersuchten Dipeptid keine Diketopiperazinbildung (DKP) festgestellt. Ein eventueller Ausbeuteverlust durch DKP-Bildung konnte durch die Kupplung von Dipeptiden mit HATU/HOAt komplett ausgeschlossen werden. Die immobilisierten Peptidthioester konnten sowohl durch Abspaltung mit Säure als ungeschütze Peptide als auch nucleophilisch mit Thiolaten als vollgeschützte Peptidthioester in guten Ausbeuten erhalten werden. Die so gewonnenen Thioester konnten direkt in Nativen Chemischen Ligationsreaktionen (NCL) angewendet werden. Um die Robustheit des MMP-Linkers zu testen, wurde ein Analogen von Penetratin 1 synthetiesiert. Nach saurer Abspaltung und Aufreinigung, konnte das 16 Aminosäure lange Peptid mit einer Ausbeute von 67 % erhalten werden. Im Zweiten Teil dieser Arbeit wurde der MMP-Linker auf die Synthese von Peptidthiosäuren angewendet. Bei nucleophiler Abspaltung der immobilisierten Peptide mit Thiolen, die zu ß-Eliminierung neigen, erhält man geschützte Peptidthiosäuren. Bei einer Abspaltung eines Pentapeptids mit Aminbasen wurde eine rasche Zersetzung der Thiosäuren beobachtet. Allerdings können diese in situ gebildeten Thiosäuren mit Tosylaziden zu den entsprechenden Sulfonamiden reagiert werden. Durch die Kombination von Abspaltung und Thiosäure/Azid-Ligation verkürzt sich das zweistufige Verfahren auf eine Eintopfreaktion. Der letzte Teil der Arbeit beinhaltete eine Optimierung der Reaktion von Thiosäuren mit elektronenreichen Aziden, die für gewöhnlich erhöhte Temperaturen für die Thiosäure/Azid-Ligation benötigen. Für eine verbesserte Reaktion wurde die Katalyse von Kupfer(I)- und Silber(I)-Salzen untersucht. Dabei wurde eine bislang unbekannte Reaktion der Thiosäure und des Azids zu einem Thioamid festgestellt. Bei genauerer Untersuchung der Reaktion zeigte sich, dass sich das Verhältnis von Thioamid und Amid weiter auf der Seite das Amides liegt, je elektronärmer das Azid war. Bei der Reaktion von Fmoc-Phe-SH mit α-Azidoglycinmethylester ergab sich ein Verhältnis von Thioamid zu Amid von 1.6:1. Die anfänglichen Untersuchungen bieten dabei eine gute Grundlage für einen zukünftigen Zugang zu Thioamiden.