Markierung primärer humaner Hepatozyten mit mikroskaligen Eisenoxidpartikeln in temporärer Suspensionskultur

Abstract

Hintergrund: Die Leberzelltransplantation stellt einen experimentellen Therapieansatz im Bereich verschiedener Lebererkrankungen dar. Um Komplikationen nach erfolgter Applikation der Leberzellsuspensionen zeitnah entgegen wirken zu können, ist die Nachverfolgung in vivo mittels eines möglichst nicht invasiven bildgebenden Verfahrens unerlässlich. Verschiedene Zellarten konnten bereits erfolgreich mit mikroskaligen Eisenoxidpartikeln (MPIO) in Adhäsion markiert und mit Magnetresonanztomographie (MRT) dargestellt werden. Für die Anwendung im klinischen Bereich ist allerdings die Markierung der Zellen in Suspension erstrebenswert. Ziel dieser Studie war es, ein für die klinische Routine praktikables Verfahren zur Markierung humaner Hepatozyten mit MPIO zu entwickeln, welches die Detektion der markierten Zellen mittels klinischer MRT ermöglicht. Methoden: Primäre humane Hepatozyten wurden aus insgesamt 25 Resektaten nach Leberteilresektion isoliert. Zunächst wurde die zur Darstellung mittels klinischer MRT notwendige Partikelkonzentration/Zelle evaluiert. Die Markierung der Hepatozytensuspensionen erfolgte im Rotary Cell Culture System. Als Kontrollgruppe dienten in Adhäsion markierte und nachfolgend enzymatisch resuspendierte Zellen sowie native Zellen in Suspensions- und Adhäsionskultur. Anschließend wurden alle Versuchsgruppen in Adhäsion rekultiviert und über einen Zeitraum von fünf Tagen hinsichtlich ihrer metabolischen Leistungen (Albumin- und Harnstoffsynthese) und möglicher Zellschädigung (Aspartat- und Alanin-Aminotransferase) untersucht. Die Partikelaufnahme wurde licht-, fluoreszenz- und elektronenmikroskopisch sowie durch den korrelierenden Eisengehalt mittels Continuum Source Atomic Absorption Spectrometry verifiziert. Ergebnisse: Die Darstellung mittels eines 3 Tesla MRT gelang bei einer Beladung von 18 Partikeln/Zelle. Für eine ausreichend hohe Partikelbeladung der Zellen in Suspension wurden wesentlich höhere Inkubationskonzentrationen benötigt als für die Markierung in Adhäsion (180 vs. 30 Partikel/Zelle). Mit dem Susupensionsverfahren ließ sich hingegen eine höhere Zellausbeute erzielen. Die Markierung blieb in beiden Gruppen über den gesamten Zeitraum stabil. Es konnten keine negativen Effekte bezüglich Zellintegrität oder metabolischer Aktivität nachgewiesen werden. Das Verfahren zur Markierung in Suspension bot jedoch aufgrund der schnelleren und effizienteren Durchführung der Markierung deutliche Vorteile und zeigte sich daher für die potentielle klinische Routineanwendung überlegen.

Background: Liver cell transplantation is an experimental approach in the treatment of distinct liver diseases. To prevent possible complications after application of liver cell suspensions, in vivo detection of transplanted cells via non-invasive imaging modalities is essential. Different cell types have been labeled with micron-sized iron oxide particles (MPIO) in adhesion culture and detected with magnetic resonance imaging (MRI). However, for application of labeled cells in the clinical routine, labeling in suspension is desirable. Aim of this study was to establish a clinically feasible method to label primary human hepatocytes with MPIO for detection with clinical MRI equipment. Methods: Primary human hepatocytes were isolated from liver specimens obtained from a total of 25 patients undergoing partial hepatectomy. First, the required particle concentration/cell for detection with clinical MRI equipment was investigated. Labeling of hepatocyte suspensions was accomplished with the Rotary Cell Culture System. Both in adhesion labeled and subsequently enzymatically resuspendend cells and native suspension- and adhesion-cultured cells served as controls. Afterwards, cells of all groups were re-cultivated in adhesion. Metabolic parameters (albumin and urea synthesis) as well as enzymatic leakage (aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT)) were investigated over a period of five days. Particle uptake was determined by light-, fluorescence- and electronmicroscopy. Findings were correlated with the results of intracellular iron uptake measured with the Continuum Source Atomic Absorption Spectrometry. Results: Imaging of labeled cells with clinical 3 Tesla MRI was feasible with a particle load of 18 particles/cell. For sufficient particle uptake in suspension, cells had to be incubated with a much higher particle concentration than for labeling in adhesion (180 vs. 30 particle/cell). However, total recovery of viable cells was higher in the suspension group. Labeling was stable during the culture period in both groups. No adverse effects on cell integrity or metabolic activity were detected. Labeling of liver cells in suspension was considered to be superior due to the faster and more efficient handling and may therefore be more applicable in the future clinical routine.