Effekte von Deltamethrin und ADP- ribosylierender C3- Exoenzyme auf die Entwicklung hippokampaler Neurone in Kultur

Abstract

Hippokampale Primärkulturen der Maus stellen ein häufig benutztes Modellsystem zur Untersuchung zellbiologischer und degenerativer Prozesse dar. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von Deltamethrin als ausgewähltem Vertreter der Insektizide auf die neuronale Entwicklung hippokampaler Zellkulturen untersucht. Dabei wurde die Überlebensfähigkeit der hippokampalen Neurone nach Gabe von Deltamethrin sowie die Effekte von Deltamethrin auf die Synthese synaptischer Proteine und das Verteilungsmuster von Kaliumkanälen untersucht. Wiederholte Gabe von Deltamethrin (2-2000nM) reduziert die Anzahl hippokampaler Neurone um 16-40%. Neuronale Degeneration wurde von der Abnahme der synaptischen Proteine (21-35%) und synaptischen Kontakte (ca. 60%) begleitet. Alle untersuchten synaptischen Proteine (Synaptophysin, Synaptobrevin, Synapsin und SNAP25) sowie Kv Kanal alpha-Untereinheiten kommen in Deltamethrin behandelten Kulturen reduziert vor. Während Synaptophysin gegenüber Deltamethrin-Behandlung relativ resistent (25% Abnahme) ist, reagieren die Kv Kanal alpha-Untereinheiten, speziell Kv1.1 (64% Abnahme) sehr sensibel. Trotz hoher Deltamethrinkonzentration überlebten eine große Anzahl der Neurone (ca. 70%), welche typische neuronale Strukturen aufwiesen. Somit scheint es, dass in hippokampalen Kulturen Subpopulationen von Neuronen vorzukommen, die eine unterschiedliche Sensitivität gegenüber Deltamethrin aufweisen. Die Deltamethrin-Behandlung reduzierte die Zahl an Calbindin- positiven Neuronen um 50%, vornehm-lich der Körnerzellen sowie somatostatinergen Neurone um 60%, jedoch stieg die Anzahl der NPY-haltiger Neurone um 250% an. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Wirkung von C3 ADP- Ribosyltransferasen, die von verschiedenen Bakterienstämmen wie Clostridium botulinum (C3bot), Clostridium limosum (C3lim) und Staphylococcus aureus (C3stau2) produziert werden, auf die sich entwickelnde hippokampalen Neuronen untersucht. Alle diese Exoenzyme besitzen die ADP-Ribosyltransferase Aktivität, die die Rho Proteine A, B und C durch ADP-ribosy-lierung inaktivieren. Die mit C3-Exoenzymen aus Clostridium botulinum (C3bot) im nanomolaren Bereich behandelten Neurone zeigten eine hochsignifikante Erhöhung der Axonlänge (ca. 70%) und Axonverzweigung (ca. 30%). C3 -Isoformen wie C3stau2 und C3lim wiesen diese wachstumsfördernde Eigenschaft nicht auf. Die Enzym-defiziente C3bot Mutanten zeigten ebenfalls signifikant erhöhtes axonales Wachstum (Länge und Verzweigung). Diese C3bot Mutanten ohne ADP- Ribosyltransferase Aktivität können Rho nicht ADP-ribosylieren. Daher können die neurotropischen Effekte der Mutanten C3bot Proteine nicht durch die Inaktivierung der Rho Proteine vermittelt worden sein. Somit besitzen C3bot Proteine eine bisher unbekannte neurotrophe Wirkung, die nicht an seine enzymatische Aktivität gekoppelt ist. C3bot Proteine binden wahrscheinlich wie einem neurotrophen Faktor an einem Rezeptor der neuronalen Zellmembran, wodurch die Signale dann weitergeleitet werden. Die mit enzymatisch aktiven C3bot und C3stau2 transfizierten Neurone zeigten eine signifikante Reduzierung der Axonlänge (ca. 30%) und Axonverzweigungen (ca. 40%). Die intrazelluläre Expression der C3 Proteine (C3bot und C3stau2 ) reduziert axonales Wachstum (Länge und Verzweigung). Da die Expression von enzym-defizientem C3 Mutanten keine Wirkung auf Axone zeigen, wurden die Wirkung von enzymdefizientem C3 Mutanten extrazellär vermittelt. Durch die ultrastrukturellen Aufnahmen konnte die wachstumsfördernde Wirkung von C3bot (enzymdefizient und enzymaktiv) bestätigt werden. Die signifikante Erhöhung der Fortsatzlänge und Anzahl der Verzweigungen bis zu 300% belegen die trophische Wirkung der C3 Exoenzyme von Clostridium botulinum (C3bot) auch bei Astrozyten. Diese als Stellation bezeichnete morphologische Veränderung wurde bei enzymdefizienten C3 Exoenzymen nicht nachgewiesen. Astrozyten scheinen ebenfalls über eine sehr affine Bindungsstelle zu verfügen, über die enzymatisch aktives C3bot in die Zelle gelangt.

Hippocampal primary cultures are a widely used model system for studying cell biology and degenerative processes. In the first part, the effect of deltamethrin on the development of hippocampal neuronal cell cultures was investigated. Repeated applications of deltamethrin (between 2 nM and 2000 nM) decreased the number of neurons by 16-40%, respectively. Neuronal death was accompanied by an overall decrease of synaptic proteins. A considerable number of neurons survived treatment with high concentrations of deltamethrin (200-2000 nM) and still displayed characteristics of mature neurons such as synaptic contacts or the expression of members of the Kv1 channel family. When analyzing subtypes of neurons calbindin- as well as somatostatin-positive neurons decreased by 50% after repeated treatment with 2 nM deltamethrin. Under the same conditions neuropeptide Y-positive neurons were up-regulated by 250%. Deltamethrin at concentrations relevant in human toxicology differentially affects survival of neuronal subtypes by exerting either deleterious or supportive effects. In the second part of the study, the effect of C3 ADP-ribosyltransferases, such as Clostridium botulinum (C3bot), Clostridium limosum (C3lim) and Staphylococcus aureus (C3stau2), were studied on the developing hippocampal neurons. Using hippocampal neurones at defined states of differentiation, i have dissected the function of RhoA in axonal and dendritic growth. Inactivation of Rho by C3-catalysed ADP-ribosylation using C3 isoforms (Clostridium limosum, C3lim) or Staphylococcus aureus (C3stau2), diminished axonal branching. By contrast, extracellularly applied nanomolar concentrations of C3 from C. botulinum (C3bot) or enzymatically dead C3bot significantly increased axon growth and axon branching. Extracellular application of enzymatically active or dead C3bot exclusively promotes axonal growth and branching suggesting a novel neurotrophic function of C3 that is independent from its enzymatic activity. Furthermore, low nanomolar concentrations of C3 isoforms (C3bot or enzymatically dead C3bot) significantly promoted process outgrowth and increased process branching in astrocytes.