Study of the murine Stem Cell E3 Ubiquitin ligase Lin41 in Development and Postnatal stages through the characterization of Lin41 Gene Trap and conditional Knockout models

Abstract

Lin41 gene encodes a member of the Trim-NHL protein sub-family, discovered in C. elegans as a master regulator of development. Lin41 is a target of the microRNA let-7, and this regulatory relationship is conserved throughout bilateral animals. Like other Trim-NHL proteins, LIN41 was shown to be an E3 ubiquitin ligase influencing the microRNA biogenesis, although its function in other biological contexts remains largely unknown. The present dissertation focused on the study of the mouse ortholog of Lin41 in different contexts, mainly using a Lin41 gene trap line as a genetic model. Using this gene trap line, I characterized the expression pattern of Lin41 during mid-gestational stages of the mouse embryo. In accordance to subsequently published studies, I described Lin41 ubiquitous expression at E8.5, which becomes restricted to structures like neuroepithelium and limb buds between E10.5 and E12.5, and is progressively lost at E13.5. In the absence of functional LIN41, mouse embryos fail to properly develop the neural tube and die around E9.5. I am the first to reveal Lin41 expression in the adult central nervous system (CNS), where is restricted to the ependymal cells of the lateral ventricle, and show its expression in an ependymal primary culture model. Due to the relationship of these cells with the subventricular zone (SVZ) neurogenic niche, the pluripotency-related LIN41 protein might be of relevance for the process of adult neurogenesis. As a new tool for the study of Lin41 in pluripotency and neural differentiation, mouse embryonic stem (mES) cell lines were derived from the gene trap mouse line. Using Lin41 null ES cells, I uncover that Lin41 is dispensable for self-renewal and pluripotency factor profile maintenance. Additionally, to achieve Lin41 mutation in a precise spatial-temporal manner, and to circumvent the embryonic lethality, we have generated the first known conditional knockout mouse model. In combination with Cre-expression under active promoters in development and adult ependymal cells we will be able to specify the importance of Lin41 in the mammalian organism. This conditional knockout provides a new, versatile tool in addition to the mES cell lines to perform developmental and postnatal specific studies of Lin41.

Das Lin41-Gen kodiert für ein Protein der Trim-NHL-Familie und wurde erstmals in Caenorhabditis elegans als elementarer Faktor für dessen Entwicklung beschrieben. Lin41 ist zudem das Zielgen der let-7 miRNA und diese regulatorische Beziehung ist durch das gesamte bilaterale Tierreich hinweg konserviert. Wie auch andere Mitglieder der Trim-NHL-Proteinfamilie besitzt LIN41 eine E3-Ubiquitinligase-Aktivität durch welche es direkt die miRNA- Funktion beeinflussen kann. Im Bezug auf andere biologische Fragestellungen ist seine Funktion hingegen noch ungeklärt. Die hier vorliegende Dissertation konzentriert sich auf die Untersuchung des Lin41-Mausorthologs in verschiedenen Kontexten und verwendet hierzu hauptsächlich eine Lin41-„Gene- Trap-Knock-out“-Mauslinie. Mit Hilfe dieses genetischen Modells wurde die Lin41-Expression in mittleren embryonalen Entwicklungsstadien der Maus untersucht. In Übereinstimmung mit später publizierten Studien konnte Lin41-Expression im gesamten Embryo bis Embryonaltag (E) 8.5 gezeigt werden. Im weiteren Verlauf der Entwicklung, zwischen E10.5 und E12.5, ist die Expression auf das Neuroepithel und die Extremitätenanlagen begrenzt und bis zum E13.5 vollständig verschwunden. Mausembryonen ohne funktionelles LIN41 besitzen ein fehlgebildetes Neuralrohr und sterben am E9.5. Es konnte zudem erstmals Lin41-Expression im adulten zentralen Nervensystem (ZNS) gezeigt werden. Hier ist es in Ependymazellen der Lateralventrikelwand exprimiert und auch in einem ependymalen Zellkulturmodell konnte Lin41-Expression nachgewiesen werden. Aufgrund der Nähe der Ependymazellen zu Zellen der adulten Stammzellnische der Subventrikulärzone (SVZ) könnte das pluripotenz- assoziierte LIN41-Protein einen Einfluss auf die adulte Entstehung von Neuronen haben. Als zusätzliche Möglichkeit Lin41s Einfluss auf Pluripotenz sowie neuronale Differenzierung zu untersuchen, wurden embryonale Stammzelllinien (ES) der „Gene-Trap“-Mauslinie etabliert. Mit Hilfe dieser „Knock-out“-ES Zellen konnte gezeigt werden, dass Lin41 keinen Einfluss auf die Zellvermehrung oder die Level von Pluripotenzfaktoren hat. Um die embryonale Lethalität der „Knock-out“-Mäuse zu umgehen und das Fehlen von Lin41 an verschiedenen Zeitpunkten und Orten zu charakterisieren, wurde das bisher erste konditionale „Knock-out“–Mausmodell erstellt. In Kombination mit Cre-Rekombinase-Expression unter der Kontrolle verschiedener Promotoren, die während der Entwicklung aktiv sind, und durch die adulten Ependymazellen wird es möglich sein, die Funktion Lin41s im Säugetier besser zu verstehen. Die konditionale Deletion des Lin41-Allels bietet in Ergänzung zu den ES- Zelllinien vielfältige Möglichkeiten Lin41 während der Entwicklung und im adulten Organismus zu untersuchen.