T-Zell-Rezeptor V beta (TRBV) Dominanz bei der inflammatorischen Kardiomyopathie (DCMi)

Abstract

Die akute Myokarditis (AMC) und die erworbene dilatative Kardiomyopathie (DCM) sind in den westlichen Ländern überwiegend auf eine Virus-induzierte intramyokardiale Entzündung zurück-zuführen. Die am häufigsten in Endomyokardbiopsien (EMBs) von Patienten mit der klinischen Präsentation einer AMC oder DCM nachgewiesenen Virusgenome sind insbesondere Parvovirus B19 (B19V), das humane Herpes Virus Typ 6 (HHV6), Enteroviren (EV, vor allem Coxsackieviren Typ B /CVB), Adenoviren (ADV) und das Epstein-Barr-Virus (EBV). Abgeleitet von tierexperimentellen Einblicken der CVB induzierten murinen Myokarditis wird davon ausgegan-gen, dass eine initial starke zelluläre Immunantwort im Rahmen einer AMC zur schnellen Viruselimination und Ausheilung führt, während eine protrahierte oder abgeschwächte Immun-antwort in Erregerpersistenz und Chronifizierung der Entzündung resultiert. Diese chronifizierte intramyokardiale Entzündung kann sich bei genetisch prädisponierten Individuen sekundär durch molekulares Mimikry auch gegen kryptische myokardiale Antigene richten, was unabhängig von der Viruselimination oder –persistenz zu einer Chronifizierung der nunmehr auch antikardialen Immunantwort und zur Entwicklung einer inflammatorischen Kardiomyopathie (DCMi) beiträgt. Eine chronische Aktivierung des Immunsystems, die sich gegen ein spezifisches (virales oder Auto-) Antigen richtet, kann zu einer deutlichen Einschränkung der Zahl spezifisch reaktiver T-Zellen in den Zielorganen führen (oligoklonale Expansionen), die mit modernen moleku- larbiologischen Methoden detektiert werden kann. Die für die Detektion von klonalen TRBV-Umlagerungen in Lymphomen etablierten BIOMED-2 Primersysteme haben sich in Vorversuchen als nicht anwendbar auf die TRBV-Untersuchungen bei Herzmuskelgewebe von DCM-Patienten herausgestellt, weil aus der relativ geringen T-Zell-Infiltration Pseudomonoklonalitäten mittels dieses methodischen Ansatzes resultieren. Eine Zielstellung dieser Doktorarbeit war es daher, ein alternatives, valides System zur TRBV-Expressionsanalyse zu entwickeln. Es wurde ein TRBV real-time RT-PCR Primer-/Sondensystem für die Quantifizierung der funktionellen humanen und murinen TRBV-Familien etabliert, das zur sensitiven und spezifischen Erfassung der relativ gering ausgeprägten T-Zellinfiltration bei DCMi geeignet ist. In diesem Rahmen sind auch neben einer effektiven RNA-Extraktion und cDNA Umschreibung der relativ geringen RNA-Mengen aus EMBs auch Präamplifikationsverfahren getestet und etabliert worden. Als effektives, präzises, reproduzier-bares und die Präamplifikationsuniformität nur geringfügig verschiebendes Präamplifikations- (PreAmp) Verfahren hat sich hierbei das auf der Basis des Taqman® preamplification Kits modi-fizierte T-PreAmp Verfahren erwiesen, das eine Genexpressionsanalyse von rechnerisch bis zu 784 Zielgenen aus jeweils einer EMB ermöglicht. Unter Einsatz dieses T-PreAmp Verfahrens konnte eruiert werden, dass auch das komplexe TRBV/TRBC gene assay Design, bestehend aus einem gemeinsamen TRBV reverse primer und 24 verschiedenen TRBV forward Primern den Präamplifikationsuniformitätsvorgaben zwischen -1,5 bis +1,5 bezogen auf das Referenz gene assay CDKN1B entspricht. Erste Ergebnisse zeigten eine mit der immunhistologischen Diagnostik der DCMi assoziierte Regulation von 32 der 91 untersuchten Zielgene. Der Einsatz der T-PreAmp real- time RT-PCR zur exakten Quantifizierung einer breiten Auswahl von u.a. immunkompetenten und an der Immunregulation beteiligten Genen ist somit methodisch etab-liert, und steht für weitere Untersuchungen inflammatorischer Prozesse bei der DCMi, z.B. zur Ergründung der prognostischen Wertigkeit der Genexpression im variablen natürlichen Erkran-kungsverlauf sowie dem Einfluss immunmodulatorischer Therapieregimes bei DCMi-Patienten offen. Weiterhin wurden in dieser Arbeit zur quantitativen Erfassung der Dominanz von funktionellen TRBV Familien an einem definierten Tiermodell der CVB induzierten chronischen Myokarditis Untersuchungen an SWR-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der CVB-Infektion durchgeführt. Die Untersuchungen sollen exemplarisch aufzeigen, welche TRBV-Dominanzen in diesem Myokarditis-Tiermodel unter identischem genetischen Hintergrund entstehen, und wel-chen dynamischen Verlauf diese TRBV Dominanzen im Verlauf nach der akuten Virus-induzierten Myokarditis aufweisen. Diese TRBV-Expressionsanalysen vermitteln wichtige Aspek-te der T-Zell-Antwort bei der CVB-induzierten murinen und der humanen DCMi. Insbesondere bei der CVB-induzierten Myokarditis ergeben sich mannigfaltige Potentiale zur experimentellen In-tervention, z.B. durch gezielte Suppression der TRBV3-Expression, zur Bedeutung von TRBV3 bei transgenen oder knock out SWR Mäusen, und ferner auch den Einflüssen von immunmodulatorischen (z.B. antiviralen IFN) Therapien. Künftigen longitudinalen Studien bleibt es zu klären, welche prognostische Bedeutung die Dominanz von bestimmten TRBVs hat, und wie sich die TRBV Expression im natürlichen Verlauf der Erkrankung, sowie unter immunmodulatorischen Therapieregimes (pharmakologische Immunsuppression mit Kortikosteroiden, Immunadsorption, antivirale IFN-Therapie) entwickelt. Bei einem Patienten mit akuter B19V Virämie und B19V assoziierter AMC konnten in PBMCs antigenspezifische CD8+ T-Zellen nachgewiesen werden, die sich mit einer hohen Frequenz gegen die NS1-Peptide SALKLAIYKA257-266 (SALK; 19,7%) und QSALKLAIYK256-265 (QSAL; 10%), und mit einer niedrigeren Frequenz gegen GLCPHCINVG613-622 (GLCP; 0,71%) und LLHTDFEQVM276-285 (LLHT; 0,06%) richten. Die Charakterisierung der SALK- und GLCP-reaktiven T-Zellen zeigte eine deutliche TRBV11 Dominanz bei diesem HLA A*02, A*11, B*07 typisierten Patienten, sowie eine Th1- (IFN, IL2, IL27, T-bet) und eine CTLs-dominierte (Perforin, Granzyme B) funktionelle Zuordnung der zellulären Immunität, während Markergene, die Th2- und regulatorische T-Zellen charakterisieren (GATA3, IL4, FoxP3), keine differentielle Expression zeigten. Die identifizierten Epitope mit den höchsten B19V CD8+ IFN Antworten (SALK und QSAL) bieten die Grundlage für die Entwicklung von Tetrameren oder Pentameren, die letztlich bei HLA 02 Patienten für eine methodisch einfach umzusetzende Identifizierung von B19V-NS1 antigenspezifischen T-Zellen in PBMCs aber letztlich auch in EMBs eingesetzt werden könnten. Nach den vergleichenden in vitro Expansionsstudien von T-Zellen aus PBMCs mittels feeder cells (FC), einem anti-CD3-Antikörper und IL2 sind die aussichtsreichsten Bedingungen für eine effektive, reproduzierbare und das initiale TRBV-Expressionsmuster nicht wesentlich beeinflus-senden durch den Einsatz von mit humanem Serum supplementiertem RPMI gegeben. Hinge-gen führen Expansionen mit fetalem Kälberserum bei vergleichbarer Expansionseffizienz zur Verschiebung des TRBV- Expressionsmusters, und serumfreie, lymphozytenspezifische synthe-tische Medien erwirken eine ungleich geringere Expansionseffizienz nach 28 Tagen Kultur (ca. 70xfach versus >1,000xfach mit Serum-supplementiertem RPMI). Die Umsetzung dieser methodischen Vorarbeiten an infiltrierenden T-Zellen aus EMBs muss zeigen, ob die zumindest aus diesen Vorarbeiten als hinreichend berechnete Expansionseffizienz ausreichend ist, um mindestens 106 T-Zellen zu expandieren, die dann z.B. zur Antigenspezifitätsprüfung der T-Zell-Infiltrate von DCMi Patienten nach publizierten Methoden eingesetzt werden könnten.

Acute myocarditis (AMC) and acquired dilative cardiomyopathy (DCM) are predominantly caused by virus induced intramyocardial inflammation in western civilisation. The most fre-quently detected viruses in EMBs of patients with clinical presentation of AMC or DCM are Parvovirus B19 (B19V), human herpesvirus type 6 (HHV6), enteroviruses (EV, especially Cox-sackievirus B/CVB), adenovirus (ADV) and epstein-barr-virus (EBV). Based on insights of the CVB induced murine myocarditis it is expected that an initially strong cellular immune response according of an AMC leads to fast virus elimination and healing whereas a decelerated or weak-ened immune response results in a virus persistence and chronic inflammation. These chronic intramyocardial inflammations can lead to an inflammatory cardiomyopathy (DCMi). A chronic activation of the immune system can result in a considerably restriction of the reactive T cells in the target organs (oligoclonal expansion), which can be detected with modern biomolecular methods. Preliminary tests showed that the BIOMED-2 primer system is not applicable for the detection of clonal TRBV rearrangements in myocardial tissue from DCM patients. Because of the rela- tively low T cell infiltration mostly pseudo monoclonalities were detected. One goal of this dis-sertation was to develop an alternative valid system for TRBV expression analysis. A TRBV real-time RT-PCR system for the quantification of functional human and murine TRBV families has been established, which is suited for sensitive and specific detection of relatively low pro-nounced T-cell infiltrations in DCMi. In this matter besides an effective RNA extraction and cDNA sythesis of low RNA amounts a preamplification method was tested and established. Based on the Taqman® preamplification kit, the modified T-PreAmp procedure showed to be an effective, precise, reproducible and the preamplification uniformity only marginally shifting preamplification method, which allows a gene expression analysis of up to 784 target genes from one EMB. First results show that in immunohistologically diagnosed DCMi 32 out of the 91 investigated target genes are regulated. The application of the T-PreAmp real-time RT-PCR for exact quantification of a broad range of immunocompetent and immuno regulating genes is therefore methodically established and is available for further investigations of inflammatory processes in DCMi patients. Furthermore, in this work, investigations for the quantitative detection of the dominance of functional TRBV families in a defined animal model of CVB-induced chronic myocarditis in SWR mice at various times after infection with CVB were carried out. These studies are to show which TRBV dominances arise in this myocarditis model under an identical genetic background and which dynamic progress these TRBV dominances show in the course of the virus induced myocarditis. These TRBV expression analyses provide important aspects of T-cell response in the CVB-induced murine and human DCMi. Particularly in the CVB-induced myocarditis many potentials for experimental intervention arise, such as targeted suppression of TRBV4 expression, the importance of TRBV4 in transgenic or knock out SWR mice, and also the influence of immuno-modulatory (eg antiviral IFN) therapies. It remains future longitudinal studies to clarify the prog- nostic significance of the dominance of certain TRBVs, and how the TRBV expression develops in the natural course of the disease, as well as under immunomodulatory therapy regime (pharmacologic immunosuppression with corticosteroids, immunoadsorption, antiviral IFN-therapy). In PBMCs of a patient with acute B19V viraemia and B19V associated AMC antigen-specific CD8+ T-cells could be detected which target with a high frequency against NS1 peptides SALK-LAIYKA257-266 (SALK; 19,7%) and QSALKLAIYK256-265 (QSAL; 10%), and lower frequencies against GLCPHCINVG613-622 (GLCP; 0,71%) and LLHTDFEQVM276-285 (LLHT; 0,06%). The characterization of the SALK and GLCP- reactive T cells showed a clear dominance of TRBV11 in this HLA A*02, A*11, B*07 typified patient and a Th1-(IFN, IL2, IL27, T-bet) and CTLs-dominated (Perforin, Granzyme B) functional mapping of the cellular immunity, while marker genes which characterise Th2- and regulatory T cells (GATA3, IL4, FoxP3) showed no differen-tial expression. The identified epitopes with the highest B19V CD8+ IFN answers (SALK and QSAL) provide the basis for the development of tetra- or pentameres that in HLA 02 patients could be used for a simple identification of B19V-NS1 antigen-specific T cells in PBMCs but ultimately, in EMBs. According to comparative in vitro expansion studies of T cells from PBMCs using feeder cells (FC), an anti-CD3 antibody and IL2 the most promising conditions for an effective, reproduci-ble, and the initial TRBV expression patterns not significantly influencing are given by the use of RPMI supplemented with human serum. In contrast, expansions with fetal calf serum with similar expansion efficiencies lead to a displacement of the TRBV expression pattern, and se-rum-free, synthetic lymphocyte-specific media obtain a much lower efficiency of expansion after 28 days of culture (approximately 70 fold versus> 1.000 fold with serum supplemented RPMI). The implementation of this methodic preliminary work on infiltrating T-cells from EMBs must show whether the calculated expansion efficiency is sufficiently adequate to expand at least 106 T-cells which then could be used to examine for example the antigen specificity of T-cell infiltrates of DCMi patients after published methods.