The influence of nicotine and smoking on the gene expression of human beta- defensins and proinflammatory cytokines in human keratinocytes (HaCaT) and in keratinized gingiva from smokers and non-smokers

Abstract

Statement of problem: The effect of smoking and nicotine on the gene expression of human beta-defensins in oral epithelia and correlations to periodontal disease susceptibility is not well understood so far. Objectives: To evaluate the gene expression of human beta-defensins-1 and -2 and the proinflammatory cytokines IL-1β and IL-6 in the immortalized human keratinocyte cell line HaCaT, after stimulation with nicotine, TNF-α and their combination (TNF-α was used as positive control), and in healthy keratinized gingival biopsies from smokers and non-smokers. Materials and methods: HaCaTs cells were cultured in six-well plates in Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM) supplemented with 10% FBS at a density of ×106. Cells were pretreated (during 12 h) with 10 μg/ml nicotine and then treated (during the following 12 h) with 50 ng/ml TNF-α or pretreated with 50 ng/ml TNF-α, and then treated with 10 μg/ml nicotine, or the cells were not pretreated but only stimulated with either nicotine or TNF-α or a combination of both. Furthermore, keratinized gingival tissue biopsies were excised, during routine surgical treatments, from healthy patients that were smokers (use of 10 ≥ cigarettes per day, n=9) and non-smokers (n=9). Total RNA from HaCaT cells and biopsies was extracted and analyzed by quantitative real-time RT-PCR for human beta- defensins-1, -2, and interleukins IL-1β and IL-6, as well as GAPDH-mRNA. Data were analyzed by Tukey’s B multiple comparison test for post hoc analysis and Mann-Whitney U Test. Results: Pretreatment of HaCaT cells with nicotine caused a significant down-regulation of hBD-2 gene expression compared to positive control (TNF-α treatment). Moreover simultaneous treatment of HaCaT cells with nicotine and TNF-α also caused a significant down-regulation of hBD-2 gene expression compared to positive control. In contrast, there was no significant effect of nicotine on the expression of hBD-1, IL-1β or IL-6 compared to positive control. The expression of hBD-1 and hBD-2 was significantly suppressed in gingival biopsies from smokers compared to non-smokers as opposed to the expression of IL-1β, IL-6 that was not significantly different. The accepted level of significance was p≤0.05. Conclusions: Nicotine affects the expression of human beta-defensin-2 in human keratinocyte cell line HaCaT and smoking the expression of human beta-defensins-1 and -2 in keratinized gingival biopsies from smokers, producing a suppressive influence in both. Clinical significance: Smoking and nicotine modulate the innate responses of the host and, more specifically down-regulate the expression of antimicrobial peptides and thus in part possibly increase the susceptibility to periodontal diseases. Smoking must be considered a significant risk factor for the initiation and progression of periodontal diseases and for the periodontal treatments outcome, so patients must be informed about the periodontal effects of tobacco smoking and the benefits of giving up smoking.

Problemstellung: Die Effekte des Rauchens und des Nikotins auf die Genexpression von humanen beta-Defensinen in den oralen Epithelzellen sowie deren Bedeutung für die Entwicklung einer Parodontalerkrankung sind nicht ausreichend untersucht. Zielsetzung: Das Ziel der Studie war, die Genexpression von humanen beta-Defensinen-1 und -2, sowie von proinflammatorischen Zytokinen IL-1β und IL-6 in den mit Nikotin und TNF-α stimulierten, immortalisierten humanen Keratinozyten der Zellinie HaCaT, sowie in den gingivalen Biopsien von Rauchern und Nicht-Rauchern zu untersuchen. Material und Methoden: Die Zellen wurden in 6-Well-Platten in Dulbecco’s Minimum Essential Medium (DMEM), angereichert mit 10 % FKS, kultiviert. Die Zellen wurden für 12 Stunden entweder mit Nikotin (10 µg/ml) oder mit TNF-α (50 ng/ml) prästimuliert um anschließend für weitere 12 Stunden korrespondierend mit beiden Stimulanzen behandelt zu werden. Die negative Kontrolle blieb unstimuliert; die positive Kontrolle erhielt eine Stimulation mit 50 ng/ml TNF-α. Des Weiteren wurde eine simultane Stimulation mit beiden Stoffen vorgenommen. Darüber hinaus wurden gingivale Biopsien von Rauchern und Nicht-Rauchern gewonnen. Die Proben stammten von gesunden Rauchern (Zigarettenkonsum ab 10 pro Tag, n=9) und Nicht-Rauchern (n=9), die sich einer routinemäßigen transgingivalen Zahnwurzelimplatation mit Gewebestanzung unterzogen hatten. Nach der RNA-Extraktion aus den Gingivaproben und Zellen wurde eine Reverse-Transkriptase-Reaktion durchgeführt, gefolgt von einer quantitativen Real-Time PCR für humane beta-Defensine-1 und -2 sowie für proinflammatorische Zytokine IL-1β und IL-6. Die Ergebnisse wurden mittels Tuckey’s B sowie Mann-Whitney U Test statistisch ausgewertet. Das Signifikanzniveau wurde bei p≤0,05 festgelegt. Ergebnisse: Die Prästimulation der Zellen mit Nikotin verursachte, verglichen mit der positiven Kontrolle (TNF-α), eine signifikante Herabsetzung der Genexpression von hBD-2; darüber hinaus war die Genexpression von hBD-2 bei der simultanen Stimulation der Zellen mit Nikotin und TNF-α ebenfalls signifikante vermindert. Dagegen konnte kein Effekt der beiden Stimulanzen auf die Expression von hBD-1, IL-1β und IL-6 in den Zellen nachgewiesen werden. Die Genexpression von hBD-2 und -1, jedoch nicht für IL-1β und IL-6, war in den gingivalen Biopsien von Rauchern gegenüber Nicht-Rauchern signifikant vermindert. Schlussfolgerung: Nikotin scheint die Genexpression von hBD-2 in den humanen Keratinozyten zu beeinflussen. Das moderate bis starke Rauchen scheint die Expression von hBD-2 und hBD-1 in der menschlichen Gingiva inhibierend zu beeinflussen. Klinische Bedeutung: Das Rauchen und das Nikotin modulierten die angeborene lokale Immunantwort, insbesondere durch Interaktionen mit dem Expressionsmechanismus von antimikrobiellen Peptiden. Dies legt die Vermutung nahe, dass das Rauchen den Verlauf und die Entwicklung der parodontalen Erkrankung negativ beeinflussen kann. Die Patienten sollten über negative Effekte des Zigarettenkonsums auf die orale Gesundheit informiert werden.