Identifikation regulatorischer Proteine des Na+K+2Cl- Kotransporters (NKCC2) in der Niere

Abstract

Der nierenspezifische Na+-K+-2Cl- (NKCC2) und der Na+-Cl- (NCC) sind integrale Membranproteine, die im distalen Tubulus lokalisiert sind. Sie sind für die transepitheliale Resorption von NaCl aus dem Primärharn von zentraler Bedeutung und wurden in der vorliegenden Arbeit im Hinblick auf ihre funktionelle Regulation näher untersucht. Das antidiuretische Hormon (ADH) bewirkt in der Niere eine luminale Insertion des Wassertransporters Aquaporin 2 (AQP2) im Sammelrohr und des NKCC2 im dicken aufsteigenden Teil der Henle- Schleife (TAL), woraufhin vermehrt Wasser und Salze zurückresorbiert werden. Ich habe untersucht, inwiefern Lipid rafts für den Einbau von NKCC2 in die Plasmamembran und die Aktivität eine Rolle spielen. Diese Versuche wurden an Nieren von adulten männlichen Brattleboro-Ratten sowie an kultivierten Zellen aus dem TAL von Kaninchen durchgeführt. Um eventuell vorhandene, auf den Transport oder die Aktivität des NKCC2 wirkende regulatorische Proteine zu finden, habe ich die Lipid raft Fraktionen mittels Massenspektrometrie analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass ein Anteil des NKCC2 wie auch des NCC in der Lipid raft Fraktion enthalten ist. Nach Kurzzeitbehandlung der Ratten bzw. der kultivierten TAL Zellen mit ADH habe ich eine erhöhte apikale Konzentration und eine Verschiebung des NKCC2 aus cholesterinarmen Membranfraktionen in die cholesterinreichen Lipid raft Fraktionen gesehen. Auch die konfokalen Aufnahmen zeigen eine verstärkte NKCC2 Kolokalisation mit dem Lipid raft-Markerlipid Gangliosid M1 (GM1) nach Applikation von ADH. Diese Effekte können durch Cholesterindepletion (CD) und somit Disintegration der Lipid rafts auf Kontrollniveau reduziert werden. Die Effekte von ADH auf den NCC haben wir ebenfalls untersucht und haben zeigen können, dass nach Kurzzeitbehandlung von Ratten mit dem V2-Rezeptor (V2-R)-Agonisten Desmopressin (dDAVP) eine verstärkte Phosphorylierung und eine Umverteilung von NCC in die luminale Membran stattfindet. Die massenspektrometrische Analyse der Lipid raft Fraktion aus dem Innenstreifen der Nieren männlicher Wistar-Ratten zeigte NKCC2 als ein in Lipid rafts enthaltenes Protein. Ein anderes Protein, das ebenfalls in Lipid rafts enthalten und als solches bereits publiziert wurde, ist das Tamm-Horsfall Protein (THP), welches ich massenspektro-metrisch bestätigen konnte. Die Resultate zeigen, dass Lipid rafts bei dem ADH-induzierten luminalen Trafficking und der Aktivität und von NKCC2 eine bedeutende Rolle spielen. Durch die massenspektrometrische Analyse der Lipid raft Fraktion habe ich eine Liste mit Proteinen erhalten, die neben dem NKCC2 in den cholesterinreichen Raft-Membranen zu finden sind. Außerdem zeigen die Ergebnisse eine neue V2-R vermittelte NCC Signalkaskade, die die transepitheliale Resorption von NaCl im frühen distalen Tubulus (DCT1) reguliert, indem nach dDAVP Stimulation der Anteil an phosphoryliertem NCC im DCT1 in der apikalen Membran ansteigt.

The kidney specific Na+-K+-2Cl- (NKCC2) and Na+-Cl- (NCC) are integral membrane proteins localized in the distal tubulus. These transporters are important for transepithelial NaCl resorption in the kidney. In the following study the functional regulation of NKCC2 and NCC was investigated. The effect of antidiuretic hormone vasopressin (AVP) in the kidney is characterized by a luminal insertion of aquaporin 2 (AQP2) in the collecting duct and of NKCC2 in the thick ascending limb of the loop of Henle (TAL), resulting in increased resorption of NaCl. I have studied the role of lipid rafts – specific membrane components rich in cholesterol – on luminal trafficking and activity of NKCC2. These investigations were done on rat kidney and on cultivated rabbit TAL cells. To identify potentially NKCC2-regulating proteins in lipid rafts, I used liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS/MS) of lipid raft fractions. My results show, that a fraction of NKCC2 as well as of NCC is present in lipid rafts. Kidneys of short-term vasopressin stimulated rats or cultivated TAL cells showed an increased amount of apical NKCC2 and a shift of the transporter into lipid raft membrane domains. Confocal microscopy reveals increased colocalization of NKCC2 with lipid raft marker ganglioside GM1 following application of AVP on cultivated TAL cells. These effects can be blunted to control level by depletion of cholesterol. The analysis of rat kidney inner stripe lipid raft fractions by LC-MS/MS resulted in a list of candidate proteins validating several lipid raft marker proteins, such as Tamm-Horsfall Protein (THP). With this method, I could corroborate NKCC2 to be a protein present in lipid rafts. Also, we studied the effect of AVP on NCC and showed, that rats treated with vasopressin-receptor 2 (V2-R) agonist desmopressin obtain a shift of intracellular NCC to the luminal membrane and increased NCC phosphorylation in 11HSD2-negative distal tubulus (DCT1). Summarized, my results show the important role of cholesterol rich lipid raft membrane domains on vasopressin induced luminal trafficking and activity of NKCC2. LC-MS/MS analysis revealed a large amount of candidate proteins in lipid rafts, being putative regulatory proteins of NKCC2. Furthermore, the results reveal a new V2-R induced NCC signal cascade, regulating transepithelial NaCl resorption.