Etablierung eines Verfahrens zur Kombination der Elektronenmikroskopie (EM) mit der Spitzenverstärkten Raman-Spektroskopie (TERS) sowie Untersuchungen zum Infektionsprozess und der Ultrastruktur des Humanen Endogenen Retrovirus K (HERV-K)

Abstract

Im Hinblick auf die Gefahren von bioterroristischen Angriffen ist es wichtig schnell und auch spezifisch Pathogene im Probenmaterial potentieller Fälle zu identifizieren. Die EM mit ihrer hohen Ortsauflösung und dem breiten diagnostischen Spektrum ist dafür eine sehr gute Methode. Um auf Einzelpartikelniveau zwischen nah verwandten und im EM identischen Erregern zu unterscheiden, wurden im Rahmen dieser Arbeit eine Methode evaluiert, welche eine korrelative Kopplung der TEM mit der TERS erlaubt. In diesem Zusammenhang wurden Schwermetallsalze zur Kontrastierung und weitere Materialien auf ihre Eignung für die korrelative TEM-TERS Technologie getestet. Dabei erwies sich PTA als das am besten geeignete Kontrastmittel. Weiterhin wurden drei verschiedene auf Silizium-basierende Grids (Si-Grids) auf ihre Verwendung im TEM und TERS untersucht. Hierbei erfüllte ein mit Siliziumnitrid beschichtetes Grid (SiN-Grid) die Voraussetzungen, wie Elektronentransparenz, hohe Partikeladsorption und Hitzestabilität, am besten. In Optimierungsversuchen wurde die Partikeladhäsion der Grids gesteigert und erste TERS-Spektren von einzelnen Pocken aufgenommen, die vorher im EM visualisiert wurden. Aufgrund der geringen Partikelstabilität konnten keine Spektren von Retroviren aufgenommen werden. Es gelang jedoch die komplette Rekonstitution eines HERV-K(HML-2) Elements sowie dessen Expression und Darstellung der Virionen in EM-Schnittpräparaten. Trotz vollständiger Rekonstitution ist das Virus nicht in der Lage in humanen und tierischen Zellen zu replizieren. Als eine mögliche Ursache konnte ein Block im Replikationszyklus nach Viruseintritt und vor der Proteinexpression gemessen werden. Dieser Block kann durch die Zugabe von Kompetition-Viren abgesättigt werden. Als einer der inhibierenden Faktoren konnte Trim5α identifiziert werden. Die Identifizierung und Analyse dieser Inhibitoren ist für das Verständnis der Biologie endogener sowie exogener Retroviren von großer Bedeutung und könnte ebenfalls helfen die Beobachtung der HERV-K-Expression in verschiedenen humanen Tumoren besser zu verstehen.

Due to the threat of bio-terroristic attacks it is important to be able to rapidly and specifically identify pathogens in environmental specimens. The high resolution of electron microscopy (EM) makes it ideal for this task. Within the framework of this thesis, a correlative combination of TEM and TERS was evaluated for its ability to distinguish between single particles of different species that appear to be identical in standard EM. For this, heavy metal salts for contrast and other materials were tested for their use in the correlative TEM-TERS technology. PTA was found to be most suitable material for contrast staining. Furthermore three different silicon-based grids were validated for their compatibility to TEM and TERS. The silicon nitride covered grids (SiN-Grids) best fulfilled the requirements of electron transparency, high particle adsorption and heat stability. In addition, particle adhesion to the SiN-Grids was further optimised, allowing the first recording of TERS- spectra of pox particles, previously visualised in EM, to be made. However, the low stability of retroviral particles prevented the recording of their spectra. Furthermore, a complete reconstitution of a HERV-K(HML-2) element was achieved and its expression and particle production demonstrated in EM thin sections. Despite complete reconstitution, the virus was unable to replicate in human or animal cells. One possible reason for this could be the demonstrated block in the replicative cycle that occurs after virus entry but before protein expression. This block could be competitively saturated by the addition of excess virus and TRIM5α was identified as one of the inhibitory factors. The characterisation and analysis of this inhibition is important for our understanding of the biology of endogenous and exogenous retroviruses and could lead to a better understanding of the expression of HERV-K that is observed in several human tumours.