Molekulare Mechanismen der Zytokin- und Ubichinon-induzierten Otoprotektion gegenüber Cisplatin

Abstract

Als Nebenwirkung des Zytostatikums Cisplatin wurde neben Neuro- und Nephrotoxizität auch Ototoxizität beschrieben. Die Schädigung ist irreversibel und führt zu Tinnitus sowie Hör-verlust und damit zu kommunikativen Einbußen oder Entwicklungsdefiziten. Ziel der vorliegen-den Arbeit ist es, otoprotektive Substanzen zu identifizieren und zugrunde liegende Signalkaska- den zu charakterisieren. Für das Zytokin Interleukin-6 (IL-6) konnte in vitro bereits limitiertes otoprotektives Potential beschrieben werden. Neben den Charakteristika der IL-6 vermittelten Protektion soll das protektive Potential des IL-6-Verwandten Oncostatin M (OSM) untersucht werden. Weiterhin soll der Einfluss von Signalmolekülen wie des Signal Transducer and Activa-tor of Transcription 3 (STAT3), der durch beide Zytokine aktiviert wird, untersucht werden. Als Ursache Cisplatin-induzierter Schäden werden erhöhte Spiegel reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) diskutiert, deshalb wird das otoprotektive Potential des antioxidativen Ubichinon sowie die Rolle des STAT3, das auch mitochondriale Funktionen aufweist, untersucht. Darüber hinaus wird der Einfluss des IL-6, OSM und Ubichinon auf die Apoptoseregulation untersucht. Explantate Corti‘scher Organe neonataler Ratten wurden für 24h mit IL-6, OSM oder bzw. simultan mit Ubichinon prä- und für weitere 24h simultan mit Cisplatin inkubiert. Haarzellen und Neuronenfortsätze wurden fluoreszenz- markiert, morphologisch evaluiert und quantifiziert. Andere Explantate wurden parallel zu IL-6, OSM und Ubichinon mit dem STAT3 Inhibitor WP1066 kultiviert, im Anschluss gleichermaßen weiterbehandelt und ausgewertet. Zudem wurden durch die Behandlungen induzierte Protein-Spiegeländerungen mittels Western Blot untersucht: STAT3, seine Serin- und Tyrosin-phosphorylierte Form wurden im Nukleus und Zytoplasma analysiert. BCL-X, BCL-2, AIF, Survivin und Bax wurden im Zytoplasma untersucht. Gruppen wurden mittels Rangsummen-ANOVA auf Unterschiede geprüft, diese wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn der p-Wert 0,05 unterschritt. IL-6, OSM und Ubichinon schützen beide Haarzelltypen statistisch signifikant vor Cisplatin-induzierter Toxizität entlang der gesamten Cochlea. Ubichinon schützt die Neuronen-Fortsätze statistisch signifikant entlang des gesamten Corti’schen Organs, die Zytokine limitiert auf einzelne Abschnitte. Die IL-6- und OSM-induzierte Otoprotektion wurde durch WP1066 aufgehoben, die durch Ubichinon-induzierte nicht. Durch IL-6-Behandlung stieg Tyrosin-phosphoryliertes STAT3 im Zytoplasma statistisch signifikant, durch OSM-Behandlung stiegen zytoplasmatisches und nukleäres, Tyrosin-phosphoryliertes STAT3 sowie zytoplasmatisches, Serin-phosphoryliertes STAT3 statistisch signifikant. Die Apoptose-regulierenden Proteine zeig-ten durch die Behandlung keine signifikanten Spiegeländerungen. Mitglieder der IL-6-Zytokin-Familie weisen neben ihren proinflammatorischen Funktio-nen otoprotektives Potential auf, das durch Tyrosin-phosphoryliertes STAT3 vermittelt wird. Ubichinon wirkt ebenfalls otoprotektiv, eine Beteiligung des STAT3 abseits seiner klassischen Rolle als Transkriptionsfaktor kann nicht ausgeschlossen werden. Die Schlussfolgerungen dieser Arbeit sind limitiert, dennoch stellt die vorliegende in vitro Studie einen Baustein auf dem Weg zum Design eines klinisch-protektiven Protokolls für betroffene Patienten dar und ermöglicht die Ableitung neuer wissenschaftlicher Fragenstellungen.

Cisplatin, a chemotherapeutic drug, can cause neuro-, nephro- and ototoxic side effects. Cisplatin-induced ototoxicity is irreversible and leads to hearing loss and tinnitus, resulting in loss of communicative skills. The aim of this study was to identify otoprotective agents and to reveal protective signaling pathways. Cytokine interleukin-6 (IL-6) is known to exert limited otoprotective potential in vitro. Next to further characterizing this protection it was to be determined, if oncostatin M (OSM), a close relative of IL-6, also induces otoprotection. Both cytokines are known to activate Signal- Transducer-and-Activator-of-Transcription-3 (STAT3), and the role of STAT3 in otoprotection was going to be investigated. Cisplatin-induced toxicity is said to be mediated via upregulation of reactive oxygen species (ROS), therefore otoprotective potential of antioxidant ubiquinone is going to be analyzed, as well as the role of STAT3 in this context, which is known to exert functions in mitochondria next to its classic role as a transcription factor. Furthermore, the influence of IL-6, OSM and ubiquinone on the regulation of apoptosis is going to be investigated. Organ of Corti explants dissected from neonatal rats were preincubated for 24h with either IL-6, OSM or ubiquinone, followed by concurrent incubation with cisplatin for another 24h. Hair cells and spiral ganglion neurons were visualized with immunofluorescence, the morphology and amount were evaluated. In other experiments, the explants were simultaneously incubated with STAT3 inhibitor WP1066 and then evaluated as above. Changes in the target protein levels following the treatment were investigated via Western blot: Total levels of STAT3 and its serine- or tyrosine-phosphorylated forms were analyzed in cytoplasmic and nuclear fractions of explant tissues. Levels of BCL-x, BCL-2, AIF, survivin and Bax were investigated in the cytoplasm. Treatment groups were examined for significant differences via ANOVA on ranks, differences were considered as significant when p was below 0.05. IL-6, OSM and ubiquinone significantly protect both hair cell types from the cisplatin-induced toxicity along the whole length of the cochlea. Ubiquinone significantly protects neurites along the whole cochlea whereas the cytokine-induced protection was limited to certain parts of the organ of Corti. Cytokine-mediated protection was abolished by WP1066, whereas ubiquinone-induced protection was not. Tyrosine- phosphorylated STAT3 increased significantly in the cytoplasm following IL-6 treatment or OSM treatment. OSM induced additional increase of nuclear translocation and of serine-phosphorylation. There were no significant changes in the level of apoptosis-regulating proteins in response to the cytokines or ubiquinone. IL-6-cytokine-family members and Ubiquinone induce otoprotective mechanisms. The mechanisms involve phosphorylation of STAT3 on one or two domains and in case of IL-6 and OSM can be blocked by STAT3 inhibitor WP1066. The mechanism induced by Ubiquinone seems to be insensitive to WP1066, suggesting involvement of other than JAK2 kinase. This study is an attempt toward designing a novel clinical protocol for patients scheduled to chemotherapy involving cisplatin. In addition, it allows to pose new scientific questions.