Inflammations-induzierte Akutphasereaktionen führen zu „Critical Illness“-Myopathie (CIM) – Serum Amyloid A als früher CIM-Marker

Abstract

Skelettmuskelatrophie mit begleitender Muskelschwäche tritt häufig bei kritisch kranken Patienten auf der Intensivstation auf. Etwa die Hälfte jener Patienten entwickeln eine besonders schwere Verlaufsform dieser Muskelschwäche, die „Critical Illness-Myopathie (CIM)“ genannt wird. CIM schränkt die Bewegungsfreiheit der Patienten ein und erhöht deren Sterblichkeit. Die Krankheit ist dadurch charakterisiert, dass die Skelettmuskelmembranen elektrisch nicht mehr erregbar sind. Dieses Charakteristikum wird für die Diagnose von CIM genutzt. Allerdings sind derzeit keine frühen CIM-Marker verfügbar. Kritisch kranke Patienten weisen oft eine generalisierte Inflammation auf. Diese Inflammation wird als einer der Hauptrisikofaktoren für CIM angesehen und induziert die Synthese inflammatorischer Zytokine wie Tumornekrosefaktor α (TNFα) und Interleukin 6 (IL-6) im Muskel. TNFα und IL-6 induzieren die Synthese von Akutphaseproteinen (APPs) wie Serum Amyloid A (SAA). Sowohl diese Zytokine als auch SAA induzieren Muskelatrophie. In wie fern sie jedoch an der Pathogenese der CIM beteiligt sind, ist unklar. Das Ziel dieser Doktorarbeit war, frühe CIM-Marker zu identifizieren, mit denen eine Differenzierung zwischen CIM- und Nicht-CIM- Patienten möglich ist und zu untersuchen, welche Rolle die Faktoren in der Muskelatrophie spielen. Es wurden 30 Intensivstationpatienten untersucht, von denen je zwei Muskelbiopsien aus dem M. vastus lateralis entnommen wurden. Die Patienten wurden elektrophysiologisch in 12 CIM- und 18 Nicht-CIM-Patienten eingeteilt. Die Biopsien wurden an den Tagen 5 (früher Zeitpunkt) und 15 (später Zeitpunkt) nach Ankunft auf der Intensivstation entnommen. Als Kontrollen wurden 5 Patienten gewählt, die sich einer elektiven orthopädischen Operation unterzogen.. Mikroarraygenexpressionsanalysen zeigten eine differentielle Regulation der Akutphaseproteine SAA1 und SAA4 zwischen Muskelbiopsien von CIM und Nicht-CIM Patienten. Quantitative Real-Time-PCR bestätigte die erhöhte SAA1- und SAA4 Expression im CIM-Skelettmuskel. Immunohistochemische Analysen stellten einen erhöhten SAA1-Proteingehalt im Skelettmuskel von CIM Patienten, insbesondere im Interstitium und der Zellmembran der Muskelzellen, dar. Die SAA1-Akkumulate waren zum späten Zeitpunkt weniger stark ausgeprägt. Um frühe Zeitpunkte der Inflammations- induzierten Skelettmuskelatrophie zu untersuchen, etablierten wir ein Mausmodell der polymikrobiellen Sepsis („Cecal Ligation and Puncture“). Mit diesem Modell konnten wir nachweisen, dass die muskuläre Saa1-Expression schon zu einem sehr frühen Zeitpunkt der Inflammation verstärkt ist. Zudem akkumulierte Saa1-Protein im Interstitium septischer Skelettmuskel. Um nachzuweisen, dass Saa direkt vom Skelettmuskel selbst während der Inflammation synthetisiert und sekretiert wird, führten wir eine Mikrodialyse im M. vastus medialis von septischen Mäusen und Kontrolltieren durch und quantifizierten das in den Dialysaten enthaltende SAA mittels Massenspektrometrie. Diese Untersuchung konnte nachweisen, dass der septische Skelettmuskel die Saa-Proteine selbst synthetisiert und sezerniert. Zellkulturversuche zeigten, dass SAA1-Protein von humanen und murinen Myozyten gebildet wird. Myozyten, die mit TNFα, IL-6 oder beiden Zytokinen gleichzeitig stimuliert wurden, zeigten eine erhöhte SAA1-Expression. Unsere Ergebnisse beweisen, dass inflammatorische Zytokine eine Akutphasereaktion in Myozyten auslösen. Die Resultate weisen darauf hin, dass der Skelettmuskel zur Akutphasereaktion während einer Inflammation beiträgt und dass dies an der CIM-Pathogenese beteiligt sein könnte. SAA1 konnte als früher CIM-Marker identifiziert werden. Allerdings sind weitere Analysen erforderlich, um die Ergebnisse in einer unabhängigen Patientengruppe zu bestätigen und die Rolle von SAA1 in der Inflammations-induzierten Muskelatrophie im Detail zu untersuchen.

Intensive care unit (ICU)-acquired weakness (ICUAW) is a serious complication during critical illness, characterized by skeletal muscle atrophy and functional deterioration. Approximately half of ICUAW patients develop severe muscle failure called Critical Illness Myopathy (CIM), preventing mobilization of affected patients and increasing their morbidity. CIM is defined by the non-excitability of skeletal muscle membranes to electrical stimuli as assessed by electrophysiological measurements. Besides electrophysiological measurements, there is no predictive marker for CIM. In addition, CIM diagnosis is only possible at advanced disease stages. One of the major risk factors of CIM is inflammation, frequently occurring in critically ill patients. Inflammation induces synthesis of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor α (TNFα) and interleukin 6 (IL-6) in muscle. Those cytokines trigger synthesis of acute-phase proteins such as serum amyloid A (SAA). Both, cytokines and SAA, induce skeletal muscle atrophy. However, if inflammation and acute phase response contribute to CIM development was unknown. The aim of this thesis was to search for early CIM markers capable to differentiate between patients with and without CIM, and to investigate their regulation in muscle. 30 ICU patients classified by electrophysiological measurements as 12 with CIM and 18 without CIM were investigated. Two consecutive biopsies from vastus lateralis were obtained at median days 5 and 15 as early and late time points. Controls were 5 healthy subjects undergoing elective orthopedic surgery. Microarray analyses revealed increased gene expression of SAA1 and SAA4 in skeletal muscle of CIM patients but not in non- CIM patients. Using quantitative Real-Time PCR, upregulation of SAA1 and SAA4 expression in skeletal muscle of CIM but not non-CIM patients was confirmed. Immunohistochemistry demonstrated that SAA1 protein was contained and accumulated in muscles of CIM patients. These accumulates resolved later during the disease process. To further investigate early time points of inflammation-induced skeletal muscle atrophy, a mouse model of polymicrobial sepsis by cecal ligation and puncture surgery was established. Muscular Saa1 expression is already increased during the very early disease phase. Immunohistochemistry showed Saa1 accumulation in the interstitium of septic skeletal muscle. Microdialysis followed by quantitative mass spectrometry demonstrated increased Saa secretion by vastus medialis of septic mice. Cell culture studies showed that SAA1 is expressed in human and murine skeletal myocytes. When exposed to TNFα, IL-6, or both together, SAA1 mRNA expression and protein content increased, indicating that inflammatory cytokines induced acute-phase response in myocytes. These data demonstrate that skeletal muscle contributes to acute-phase response during inflammation. This is the first description of acute-phase response in skeletal muscle of CIM patients. In conclusion, acute-phase response occurs in skeletal muscle of critically ill patients probably facilitating CIM development, and SAA1 plays a predominant role in this process. SAA1 might be useful as early CIM marker to predict the disease before complete muscle destruction appears. However, further analyses are required to prove those results in an independent group of patients, and to identify the role of SAA1 in the pathogenesis of CIM in detail.