Regulation der Erythropoietin-Expression in renalen Tumoren und daraus etablierten Zell-Linien

Abstract

Die Genexpression Erythropoietins (EPO) ist durch ihre ausserordentliche Gewebe- und Zellspezifitaet gekennzeichnet. Fuer die Expression notwendig ist die Aktivierung des HIF (hypoxia-inducible factor)-Transkriptionskomplexes, der durch das pVHL (Protein von Hippel-Lindau) reguliert wird. Ungeachtet dessen ist der Mechanismus dieser restriktiven EPO-Expression bislang aber unklar und ist daher Gegenstand intensiver Forschung, insbesondere im Hinblick auf die hohen Kosten, die klinisch bei der Behandlung mit rekombinantem Erythropoietin entstehen.In dieser Arbeit zeigten 9 (ca. 40%) der 22 untersuchten, renalen Tumorgewebsproben im RNase Protection Assay (RPA) eine EPO-Expression. Aus diesen 22 Tumorgewebsproben wurden primaere Zell-Linien etabliert, die, ergaenzt mit weiteren, extern gewonnenen Zellkulturen, 24 Zell-Linien fuer diese Arbeit zur Verfuegung stellten. Im Immunoblot konnte hier das Muster einer konstitutiven Expression der HIFa-Isoformen bei einer deutlichen Ueberzahl (17/24) nachgewiesen werden. Damit wurde indirekt eine Funktionseinschraenkung im pVHL angenommen, zudem schienen die Vorraussetzungen fuer eine EPO-Expression erfuellt. Trotzdem konnte im RPA bei keiner dieser Zell-Linien eine EPO-Expression gefunden werden. Dies war insofern unerwartet, als dass die 40% EPO-positiven Tumore auch eine EPO- Expression in der Zell-Linie hatten vermuten lassen, die notwendige HIF- Aktivierung gezeigt war und vorherige Arbeitsgruppen das erfolgreiche Etablieren einer stabil EPO-exprimierenden Zell-Linie beschrieben hatten. Kontraer zu diesem Ergebnis zeigte der Nachweis im RPA der CA-9 (Carboanhydrase-9) mRNA-Expression in denselben Zell-Linien eine HIF-1 konforme Expression.Bei der Abklaerung moeglicher Ursachen konnte mittels in- situ-Hybridisierung bestaetigt werden, dass die Tumorzellen Ort der EPO- Expression waren, aus denen die Zell-Linien etabliert wurden. Einen weiteren Versuch, eine EPO-exprimierende Zell-Linie zu etablieren, schien die in der Literatur beschriebene familiaere Polyzythaemie mit der Chuvash -Mutation des VHL-Gens zu erlauben. Aber auch nach stabiler Transfektion der bereits publizierten Zell-Linie RCC-4 mit dieser Chuvash -Mutation konnte unter in vitro Bedingungen keine EPO-Expression detektiert werden. Es ist daher festzuhalten, dass das Vermoegen, EPO zu exprimieren, offensichtlich in vitro verloren geht trotz Aktivierung des notwendigen HIF- Transkriptionskomplexes. Auch das Erzeugen eines stabilen VHL-Transgens konnte in vitro keine EPO-Expression hervorrufen. Auf die EPO-Expression in vitro scheinen daher weitere, bislang unbekannte Faktoren repressiven Einfluss auszuueben. Ob diese auch an der ausserordentlich gewebs- und zellspezifischen Expression in vivo beteiligt sind, bedarf weiterer Forschung.

Erythropoietin (Epo) is the single most important stimulatory factor for erythropoiesis thereby directly involved in oxygen supply of the peripheral tissue. Physiologically, its gene expression is restricted to a small number of cells in the kidney. Dysregulation of Epo expression can be observed in certain diseases. Knowledge of the underlying molecular mechanisms will contribute to better understanding, perhaps even enable utilization of the system. So far it is well-established that induction of EPO requires the activation of HIF (hypoxia-inducible factor). HIF is targeted by the protein von-Hippel-Lindau (pVHL) which leads to its proteasomal degradation under normoxic conditions. Despite the advanced knowledge of oxygen sensing and regulation of HIF, the precise mechanism of the restricted Epo expression and the frequency of its expression in renal cell carcinoma remains unclear. 22 renal carcinomas were therefore investigated for their Epo expression using RNase protection assay from which about 40% showed an Epo expression. In addition 24 primary cell lines were analyzed which had been established from the renal carcinomas or were generated externally. Immunoblotting revealed a constitutive expression of HIFa in most cell lines (17/24) putatively associated with pVHL inactivation. Epo expression could not be observed in any primary cell line. This was unexpected since about 40% of the original tumor tissues had shown an Epo expression. In contrast, detection of CA-9 (carbonic anhydrase-9) expression, another HIF target gene, in the primary cell lines confirmed that HIF was activated. In order to address this absence of Epo expression in the cell lines in-situ- hybridization was performed. It was confirmed that the tumor cells were responsible for Epo production from which the primary cell lines had been generated. Stable transfection of RCC-4 cells with the Chuvash -mutation of the VHL gene which is related to congenital polycythemia could not establish an Epo producing cell line. It can be concluded from these data that HIF activation is necessary for Epo expression, but this is clearly not sufficient. Furthermore, expression of Epo in tumour tissues does not translate into cell cultures. Stable transfection of the Chuvash -mutation could not induce Epo expression in RCC-4 cells, therefore does not represent a gain-of-function situation. This implies that factors unknown up to now repress Epo expression in vitro and in vivo, which are most likely different. If those are involved in the tissue and cell specific Epo expression in vivo needs further to be investigated.