Development of a labeling strategy for the synthesis of fluorescent libraries of peptides and small molecules and their use in fluorescence-based binding assays for the study of protein-protein interactions

Abstract

Protein-protein interactions are involved in many metabolic pathways. However, their study and inhibition is difficult. In this dissertation project, a novel tool targeting protein-protein interactions has been designed. A labeling resin was synthesized by linking N-Fmoc-aminofluorescein to trityl resin and applied either for C-terminal labeling of peptides, or for small molecules labeling. In the first part of the project, libraries of C- and N-terminally fluorescein labeled peptides for the CD2BP2 and PERQ2 GYF domains were synthesized and evaluated in FP assays. A probe suitable for screening was found for the CD2BP2 GYF domain: the peptide Fluo-Bpa-EFGPPPGWLGR-NH2, with an affinity of 2.3 µM and a Z’ factor of 0.87. A screening of the 16,896 compounds of the ChemBioNet library was realized using a displacement assay with FP detection, and lead to the discovery of primary hits that were further evaluated by independent methods: NMR, ITC and CD but could unfortunately not be validated. Indeed, autofluorescence of the small molecules interfered in the assay and lead to many false positives. In a second approach, a diversity set of 265 fluorescein labeled small molecules was synthesized. The fragments were linked to the fluorescein resin either by amide bond formation, or by nucleophilic substitution after conversion of the aniline into an electrophile by addition of bromoacetic acid. This library was tested for affinity on twelve different proteins using a "direct" FP assay with inverse read-out, where an increased FP signal corresponds to binding of the small molecule to the protein. As a result, primary hits were found for almost all proteins, and validated with FP titration for the CD2BP2 GYF domain.

Protein-Protein Wechselwirkungen sind komplexe Prozesse, die an vielen metabolischen Signalwegen beteiligt sind. Ihre Untersuchung ist schwierig. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein neues Tool zur Aufklärung von Protein- Protein Wechselwirkungen mittels Fluoreszenzpolarisation (FP) entwickelt. Ein Festphasenlabelingreagenz für die C-terminale Markierung von Peptiden und kleinen Molekülen wurde durch Immobilisierung von N-Fmoc-Aminofluorescein an Tritylharz hergestellt und für das C-terminale Markieren von Peptiden oder von kleinen Molekülen verwendet. Im ersten Teil des Projektes wurden Bibliotheken von C- und N-terminal gelabelten Peptiden für die CD2BP2- und die PERQ2-GYF Domänen hergestellt und in FP-Assays evaluiert. Eine geeignete Sonde für ein Screening mit der CD2BP2-GYF Domäne wurde gefunden: Das Peptid Fluo-Bpa- EFGPPPGWLGR-NH2, mit einer Affinität von 2.3 µM und einem Z’ Faktor von 0.87. Das Screening der 16 896 Verbindungen der ChemBioNet Substanzbibliothek wurde mit einem FP-Verdrängungsassay durchgeführt. Die primären Hits konnten jedoch durch Untersuchung mit weiteren unabhängigen Methoden (NMR, ITC, CD) nicht validiert werden. Die Eigenfluoreszenz vieler Verbindungen führte zu falsch positiven Hits. Im zweiten Teil des Projekts wurde mit dem Festphasenlabelingreagenz eine Bibliothek hoher Diversität von 265 mit Fluorescein markierten Molekülen hergestellt. Die Fragmente wurden entweder durch Amidkupplung oder nach vorheriger Umwandlung des Anilins in ein Elektrophil mittels Kupplung von Bromessigsaüre durch nukleophilen Angriff an das Harz gekuppelt. Die Affinität dieser Moleküle zu zwölf verschiedenen Proteinen wurde in einem „direkten“ FP Assay untersucht, bei dem eine Erhöhung des FP Signals einer starken Bindung des Moleküls zum Protein entspricht. Für die meisten Proteine wurden Hits gefunden und für die CD2BP2-GYF Domäne durch Titration validiert.