In vitro mimicking of estrous cycle stages based on a comprehensive porcine oviduct epithelial cell culture model

Abstract

The oviduct epithelium is an important reproductive venue where gamete transport, sperm capacitation, oocyte maturation, and early embryo development occur. To understand the fundamental molecular mechanisms of these events, as well as to provide a tool for reproductive toxicity testing, a standardized in vitro oviduct epithelium model is on request. Although oviduct epithelium is reported to be sensitive to changes in circulating steroid hormones during estrous cycle, cyclic cellular events, especially sperm-epithelium binding and cilia activity are not well understood yet. In vitro investigations are needed to reveal principle regulatory mechanisms of hormones on cellular functions. We firstly developed a validated, comprehensive culture model of POEC. After the systematical assessment of standard sera, 3T3 medium conditioning, culture duration, and effects of cryopreservation on cells from 25 donor animals, a dossier of validation on these parameters was provided. The results suggest that cells faithfully recapitulated the morphology, ultrastructure and functionality of oviduct epithelium in vivo. TEER measurement indicated that cells maintained tissue polarity and cell type specific tight junctions. Furthermore, the stable mucin secretion and consistent expression of functional markers revealed that cells maintained an in vivo-like, homeostatic status from 3w up to 6w. Based on the POEC model, we could simulate estrous stages by mimicking the endocrine profiles of E2 and P4 for physiological time period. Cells exhibited distinct changes in cellular height and cilia density, which directly proved that E2-domination (estrus) induces cell polarization and ciliogenesis, but P4-domination (diestrus) suppresses these effects. Changes in composition of cell population suggested that E2 and P4 affected the transformation of ciliated cells and secretory cells. The TEER measurement revealed the cyclic changes of oviductal electrophysiology. In addition, simulated diestrus decreased expression of hormonal receptors and other oviductal markers, while subsequent estrus up-regulated these genes. Moreover, increased sperm binding was observed in simulated estrus compared to simulated diestrus. Finally, we developed a novel approach, which could be routinely used to monitor the cilia activity. With the assistance of the commercial AndroVision™ software, we detected the typical movement patterns of apical fluid streams. Fixed flowing routes suggested the directivity of fluid stream along the epithelium lining. Driven by cilia, beads were travelling at high speed comparable to ex vivo studies. However, there was no difference in the transport speed during estrous simulation. To summarize, our model together with the present approach to monitor cilia activity is a promising tool for basic reproductive science, as well as for reproductive toxicity testing. We present the first in vitro simulation of estrus cycle stages on mammalian oviduct epithelial cells, and revealed roles of E2 and P4 on oviduct development and functionality.

Das Eileiterepithel ist ein entscheidender Ort der Reproduktion, an dem der Gametentransport, die Kapazitation, die Oozytenreifung und die frühe Entwicklung des Embryos stattfinden. Um die fundamentalen molekularen Mechanismen dieser Ereignisse zu verstehen und ein Werkzeug zur Durchführung reproduktionstoxikologischer Analysen zur Verfügung zu haben, wird ein standardisiertes in vitro Modell des Eileiterepithels benötigt. Obwohl nachgewiesen wurde, dass das Eileiterepithel sensitiv ist für Veränderungen der zirkulierenden Steroidhormone innerhalb des Sexualzyklus, ist bisher wenig über die zellulären Veränderungen, insbesondere die Bindungsfähigkeit von Spermien und die Zilienaktivität, bekannt. In vitro Untersuchungen können hier eingesetzt werden, um die regulatorischen Wirkungen der Hormone auf die zellulären Funktionen aufzudecken Wir haben zunächst ein umfassendes und valides in vitro Modell porciner Eileiterepithelzellen (POEC) entwickelt. Nach systematischer Untersuchung von Standardseren, einer Konditionierung des Mediums durch 3T3-Zellen, der Kulturdauer und der Auswirkung der Kryokonservierung auf die Zellen 25 verschiedener Donortiere wurde ein Dossier der Validierung dieser Parameter erstellt. Die Ergebnisse belegen eine deutliche und zuverlässige in vitro Rekapitulierung der Morphologie, der Ultrastruktur und der Funktionalität von Eileiterzellen in vivo. Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstandes (TEER) zeigten, dass die Gewebepolarität und die Ausbildung zellartspezifischer Tight junctions erhalten sind. Zudem bestätigten die beständige Mucinsekretion und die gleichbleibende Expression verschiedener funktionaler Marker die Aufrechterhaltung eines homöostatischen Status über einen Zeitraum von drei bis sechs Wochen, der zudem dem von in vivo Eileiterepithel gleicht. Auf Basis dieses POEC Modells wurden verschiedene Stadien des Sexualzyklus in vitro durch ein Nachstellen des endokrinen Profils von Prostaglandin E2 (E2) und Progesteron (P4) in physiologischer Dauer simuliert. Die Zellen zeigten deutliche Veränderungen in Bezug auf ihre Höhe und die Dichte ihrer ausgebildeten Zilien, so dass eine Induzierung der Zellpolarisierung und der Ziliengenese durch E2-Dominanz (Östrus) sowie eine Suppression dieser beiden Faktoren durch P4-Dominanz (Diöstrus) nachgewiesen wurde. Veränderungen in der Zusammensetzung der Zellpopulation veranschaulichten zudem, dass E2 und P4 die Transformation zilien-besetzter und sekretorischer Zellen beeinflussen. Mit Hilfe von TEER Messungen konnten die zyklischen Veränderungen in der Elektrophysiologie des Eileiterepithels aufgezeigt werden. Zudem bewirkte eine Simulation des Diöstrus eine Herunterregulierung der Expression von Hormonrezeptoren und weiteren für das Eileiterepithel spezifischen Markern, während die Expression der entsprechenden Gene im anschließenden Östrus herauf reguliert wurde. Es wurde außerdem eine vermehrte Spermienbindung in der Simulation des Östrus im Vergleich zu der des Diöstrus nachgewiesen. Schließlich haben wir ein neues Verfahren entwickelt, welches routinemäßig zum Monitoring der Zilienaktivität eingesetzt werden kann. Mit Hilfe der AndroVision™ Software wurden die typischen Bewegungsmuster der apikalen Flüssigkeit aufgezeichnet. Festgelegte Bewegungslinien der Flüssigkeit lassen einen gerichteten Flüssigkeitsstrom entlang der epithelialen Schicht vermuten. Durch die Zilien in Bewegung versetzte Beads zeigten eine hohe Geschwindigkeit vergleichbar zu der in ex vivo Experimenten. Es konnte kein Unterschied in der Transportgeschwindigkeit in Abhängigkeit des jeweiligen Zyklusstadiums festgestellt werden. Zusammenfassend zeigt sich unser Eileiterepithelmodell in Kombination mit dem Verfahren zum Monitoring der Zilienaktivität als ein vielversprechendes Werkzeug für die Grundlagenforschung in der Reproduktion sowie für Analysen bezüglich der Reproduktions- und Zilientoxizität. Wir simulierten hier erstmals verschiedene Stadien des Sexualzyklus an Eileiterepithelzellen von Säugetieren und konnten die damit verbundene Funktion von E2 und P4 in Bezug auf die Entwicklung und die Funktionalität des Eileiters nachweisen.