Untersuchungen zur Biomechanik und Histomorphologie von Tissue engineering Knorpel aus humanen Nasenseptumchondrozyten

Abstract

In der Medizin gibt es einen großen Bedarf an Knorpelersatz, der durch bisherige Verfahren nicht zufriedenstellend gedeckt werden kann. Die autologe Transplantation ist die verbreitetste Technik, wird aber durch das geringe Material, das zu Verfügung steht, stark eingegrenzt. Andere Methoden bergen unerwünschte Risiken wie Infektion oder Abstoßungsreaktion. Einen Ausweg könnte in vitro hergestellter, autologer Knorpel bieten, der mit den Erkenntnissen des Tissue engineering aus einer Patientenbiopsie hergestellt wird. Das Ziel dieser Dissertation war es, die biomechanischen Eigenschaften von in vitro hergestelltem und in vivo gereiftem Knorpel denen des nativen, hyalinen Knorpels und seinen klinischen Anforderungen gegenüberzustellen. Humane Chondrozyten wurden enzymatisch aus Nasenseptumknorpel isoliert und in Monolayerkultur vermehrt. Mit kommerziellem Fibrinkleber wurden die Zellen in einem vollresorbierbaren Polymer-Vlies gleichmäßig dreidimensional verteilt, fixiert und mechanisch stabilisiert. Nach der Auspolymerisierung wurde eine Kapsel mit einer etwas dünneren Zellsuspension und Fibrinkleber um das Zell- Polymer Konstrukt aufgetragen. Die so entstandenen Transplantate (n= 33) wurden in die Subkutis von Nacktmäusen implantiert. Eine Maus mit zwei Implantaten verstarb frühzeitig. In der ersten Gruppe (n= 14) wurde der Tissue engineering Knorpel nach sechs Wochen, in der zweiten Gruppe (n= 17) nach zwölf Wochen explantiert. Von beiden Gruppen des Neoknorpels wurden mittels eines standardisierten Drucktestes die Versagensspannung und das Elastizitätsmodul bestimmt. Nativer Nasen-septumknorpel diente dabei als Referenzgruppe. Anschließend wurden die getesteten Gewebestücke histologisch untersucht. Die Chondrozyten hatten sich in vivo redifferenziert und knorpeltypische Matrix synthetisiert. Das neu gebildete Gewebe zeigte dem hyalinen Knorpel ähnliche makroskopische und histologische Charakteristika. Die Gruppe nach zwölf Wochen hatte die Erscheinung eines differenzierteren Gewebes als nach sechs Wochen. Die mit dieser Messmethode gewonnenen Ergebnisse konnten eindeutig nachweisen, daß bei den getesteten biomechanischen Werten zwischen den drei Gruppen, humaner Septumknorpel, 6 -Wochen-Gruppe und 12-Wochen-Gruppe kein signifikanter Unterschied bestand. Weder im Elastizitätsmodul (p= 0,170) noch bei der Versagensspannung (p= 0,964) war eine signifikante Differenz zwischen Tissue engineering Knorpel und nativem Nasenseptumknorpel festzustellen. Diese Aussage traf ebenfalls auf beide TE Knorpel-Gruppen zu, die sich auch untereinander nicht signifikant unterschieden. Die geringe Streubreite der 12-Wochen-Gruppe in ihren Ergebnissen bestätigte die qualitativ gute Standardisierung der Transplantatherstellung. Die vorliegende Arbeit führte mit ihren Ergebnissen den Nachweis, daß mit Hilfe von Tissue engineering aus einer kleinen Biopsie um ein Mehrfaches größere, autologe Knorpeltransplantate hergestellt werden konnten, die typische Knorpelcharakteristika aufwiesen und sich biomechanisch nicht signifikant von nativem hyalinen Septumknorpel unterschieden. Mit den gewonnen Erkenntnissen konnte die Aussage getroffen werden, daß der so hergestellte Neoknorpel den klinischen Anforderungen der rekonstruktiven Chirurgie entspricht. Für die Anwendung in der orthopädischen Chirurgie waren die mechanischen Eigenschaften zu gering, so daß noch eine deutliche Verbesserung des Herstellungsprozesses erforscht werden muß.

The purpose of the study was to examine the morphology and biomechanical characteristics of in vivo cultured tissue-engineered human septal cartilage as a prospective autogenous transplant material for subcutaneous implantation in reconstructive procedures. Chondrocytes were enzymatically isolated from human septal cartilage biopsies. The cell number was expanded in monolayer culture. Chondrocytes were then fixed on a non-woven poly-lactide-poly- glycolide (PGLA) polymer scaffold by means of fibrin glue. The PGLA-polymer construct was implanted subcutaneously on the back of athymic mice and allowed to mature for 6 or 12 weeks. After killing the mice, the formed cartilage was tested on a material testing machine with a highly standardized reproducible setting. Biomechanical testing consisted of an indentation test, which revealed the failure load and compressive modulus of the neocartilage. The failure load shows the upper limit of supported stress. The compressive modulus is a measure of the templates' stiffness. After testing, the templates were histologically stained. Native human septal cartilage served as a control group. Histological and macroscopic examination showed cartilage formation of a hyaline-like morphology. Histological staining revealed the synthesis of abundant mucopolysaccharid matrix. The biomechanical characteristics of neocartilage proved to be of no statistical difference compared to native human septal cartilage. The failure load and compressive modulus were initially somewhat lower and reached the control group's results after 12 weeks in-vivo. Summarizing, tissue engineered nasal cartilage matches typical mechanical characteristics of native hyaline cartilage. Its elasticity and failure load are of sufficient quality to meet the clinical requirements for reconstructive surgery.