Entwicklung einer Methode zum Nachweis von pathologischen Prionen mittels Plasminspaltung in humanem Plasma

Abstract

Die Möglichkeit der Übertragung von vCJD durch Bluttransfusionen stellt ein großes Risiko für das Blutspendewesen dar. Dieses Risiko könnte durch die Einführung eines Screening-Tests zum Nachweis von vCJD in präklinischen Stadien minimiert werden. Auf der Suche nach einer geeigneten Plattform zur Entwicklung eines Screening-Test im Blut wurde die PrPC-Spaltung durch mittels Streptokinase (SK) aktiviertes Plasminogen und/oder Aufdecken von Kryptepitopen in PrPSc nach Denaturierung untersucht. In einem speziell konzipierten ELISA-Test mit zwei monoklonalen Antikörpern wurde die PrPC- Spaltung durch endogenes Plasmin nachgewiesen. Nach 60 Minuten Inkubation bei 37°C mit 44 kU/ml SK wurden nur 20 % der PrPC-Ausgangskonzentration im Plasma detektiert. Humane Plasmaproben, aufgestockt mit Hirnhomogenisaten aus gesunden und an Scrapie erkrankten Hamstern, wurden nach vier verschiedene Vorbehandlungen im ELISA ausgetestet: native Proben, Proben nach Plasminspaltung, denaturierte Proben und Proben nach Plasminspaltung und Denaturierung. Unter diesen Testbedingungen konnte keine PrPSc-Spaltung durch SK-aktiviertes Plasminogen festgestellt werden. Die Denaturierung der pathologischen Proben konnte eine Scrapie-Hirnhomogenisat-Verdünnung in Humanplasma von 10-3,5 signifikant von den normalen Proben unterscheiden. Die Einführung der Plasminspaltung vor der Denaturierung erzeugte einen signifikanten Unterschied der pathologischen Proben von den normalen Proben bis zu einer Hirnhomogenisat-Verdünnung in Humanplasma von 10-3,6. Der entwickelte ELISA-Test ist ein neues und relativ einfaches Verfahren zum Nachweis von PrPSc in humanem Plasma. Nach Optimierung der Nachweisgrenze könnte er zum Blutspender-Screening-Test weiterentwickelt werden.

The possibility of vCJD-transmission by blood transfusion represents a high risk for blood supply. The implementation of a screening test for detection of vCJD in preclinical stages could minimize that risk. In search of appropriate platform for the development of a blood screening test the PrPC cleavage by streptokinase (SK) activated plasminogen and/or exposure of a cryptepitopes in PrPSc after denaturation was investigated. In a special designed ELISA test with two monoclonal antibodies the PrPC cleavage by endogenous plasminogen was demonstrated. After 60 minutes incubation at 37°C with 44 kU/ml SK only 20% of the PrPC initial concentration were detected. Human plasma samples, spiked with brain homogenates from normal and scrapie-infected hamsters, were investigated in ELISA after four different pretreatments: native samples, samples after plasmin cleavage, denaturated samples and samples after plasmin cleavage and denaturation. Under the test conditions PrPSc cleavage by SK- activated plasminogen couldn’t be detected. The denaturation of the samples significantly differentiated between normal and pathological samples up to 10-3,5 dilution of scrapie-infected brain homogenate in human plasma. The implementation of plasmin cleavage before the denaturation produced a significant difference between the pathological and normal samples up to 10-3,6 homogenate dilution in plasma. The represented ELISA test is new and relative simple procedure for detection of PrPSc in human plasma. After further optimization of the detection limit it could be used as blood donors screening test.