Nitroxide spin probes in dermatopharmacology: method development using electron paramagnetic resonance spectroscopy

Abstract

The thesis focuses on the use of spin probes for EPR-based method development in dermatology and pharmacology. Spin probes can be used for the detection of free radicals and the antioxidative capacity, which are important diagnostic methods in dermatology. Primarily, it was evaluated whether it is necessary to use human skin or if animal skin is suitable for UV-induced free radical detection using the spin probe PCA. It was found that the antioxidant network of the skin does not influence free radical detection and that all skin types can be used, whereas porcine skin was found to be the most suitable skin type. Using porcine skin and the developed method for free radical detection, radical formation could also be measured in the infrared spectral range. In order to improve the poor skin penetration of the spin probe PCA, it was incorporated into nanocarriers. W-band measurements revealed an exclusive PCA localization in the hydrophilic compartments of the carriers. CMS nanotransporters enhanced PCA penetration most excellently followed by invasomes. Moreover, it was found that CMS nanotransporters mainly penetrate the superficial, less dense layers of the stratum corneum, whereas invasomes deliver PCA in particular to deeper stratum corneum layers. In addition to the ability of free radical detection, spin probes can be used for the determination of the antioxidative capacity of the skin. An in vivo method was developed by using the spin probe TEMPO, which is reduced by the skin antioxidant system. Quantification of the carotenoid antioxidant substances ß-carotene and lycopene unravelled a correlation between carotenoid content and TEMPO reduction. This is a first indication that carotenoids can serve as a marker for the entire antioxidant system. The fast reduction of TEMPO is advantageous for the determination of the antioxidative capacity. For the detection of free radicals produced by inflammatory skin diseases, longer measurement times and protected spin probe delivery to the site of inflammation are necessary. Therefore, TEMPO was applied within an invasome suspension. High frequency W-band measurements demonstrated that TEMPO is located in both the lipophilic and hydrophilic compartments. Studies on porcine skin ex vivo revealed a two-fold increased measurement time compared to TEMPO solution and the reduction was significantly slowed down in vivo on human volunteers. The stabilizing effect is due to membrane located and therefore protected TEMPO. Additionally, during penetration, the amount of TEMPO associated with the membrane phase increased and the immediate polarity of TEMPO decreased. TEMPO was also loaded to NLCs and the same experiments were performed as with invasomes. It was found that the distribution of TEMPO within the nanocarriers had an impact on prolonged measurement times. Compared to invasomes, NLCs had less TEMPO associated with the lipid compartments, which lead to a reduced measurement time. However, compared to solution, NLCs also increased the measurement time, indicating stabilization and slow release of TEMPO. This thesis has shown that EPR spectroscopy using nitroxide spin probes is able to monitor (a) the antioxidative capacity in vivo, (b) oxidative stress induced by irradiation or other stressors, and can investigate (c) the penetration enhancement and stabilization of spin probes by nanotransporters from in vitro to in vivo. For (a) and (b) an L-band EPR spectrometer is sufficient, for (c) multi-frequency EPR is necessary.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Einsatz von Spinsonden für die EPR-basierte Methodenentwicklung in der Dermatologie und Pharmakologie. Spinsonden können für den Nachweis von freien Radikalen und zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität verwendet werden, welche beide wichtige diagnostische Verfahren in der Dermatologie sind. Zunächst wurde untersucht, ob es notwendig ist, Humanhaut für den Nachweis UV-induzierter freier Radikale zu verwenden, oder ob Tierhäute eine Alternative bieten. Zum Nachweis der Radikalbildung wurde die Spinsonde PCA verwendet. Es zeigte sich, dass die Antioxidantien der Haut keinen Einfluss auf den Nachweis freier Radikale haben und dass alle untersuchten Hauttypen geeignet sind, wobei sich Schweinehaut als besonders geeignet herausstellte. Mit Hilfe der entwickelten Methode zum Nachweis freier Radikale, konnte die Radikalbildung in Schweinehaut nach IR-Bestrahlung gemessen werden. Um die Penetration der Spinsonde PCA in die Haut zu verbessern, wurde diese in Nanocarrier eingearbeitet. Messungen im W-Band ergaben eine ausschließliche Lokalisation von PCA in den hydrophilen Kompartimenten der Nanocarrier. CMS Nanotransporter verbesserten die PCA Penetration am stärksten, gefolgt von Invasomen. Darüber hinaus zeigte sich, dass CMS Nanotransporter hauptsächlich in die oberflächlichen, weniger dicht gepackten Schichten des Stratum corneums penetrieren, wohingegen Invasomen die PCA Penetration in tiefere Schichten des Stratum corneums begünstigen. Neben der Messung von freien Radikalen, können Spinsonden auch für die Bestimmung der antioxidativen Kapazität der Haut verwendet werden. Mit Hilfe der Spinsonde TEMPO, die schnell durch die Antioxidantien der Haut neutralisiert wird, wurde eine in vivo Methode zur Bestimmung der antioxidativen Kapazität der Haut etabliert. Durch zusätzliche Bestimmung der Carotinoide ß-Carotin und Lycopin zeigte sich, dass der Gehalt an Carotinoiden mit der Reduktionsrate von TEMPO korreliert. Dies ist ein erster Hinweis darauf, dass die Carotinoide als Marker für das gesamte antioxidative System dienen können. Für die Bestimmung der antioxidativen Kapazität ist die schnelle Reaktion von TEMPO mit den Antioxidantien der Haut von Vorteil. Für die Bestimmung von freien Radikalen, die bei entzündlichen Hauterkrankungen produziert werden, sind jedoch längere Messzeiten sowie ein geschützter Transport der Sonde zum Entzündungsherd wichtig. Aus diesem Grund wurde TEMPO in einer Invasomen- suspension eingesetzt. Messungen im W-Band zeigten, dass sich TEMPO sowohl in der lipophilen als auch in der hydrophilen Phase der Invasomen befindet. Ex vivo Untersuchungen an Schweinehaut zeigten eine zweifach erhöhte Messzeit im Vergleich zur TEMPO-Lösung. Auch in vivo Messungen an Probanden zeigten, dass TEMPO nach Applikation in Invasomen langsamer reduziert wird als nach Applikation in Lösung. Die stabilisierende Wirkung beruht darauf, dass sich TEMPO teilweise in der Membran der Invasomen befindet und dadurch geschützt ist. Dies zeigte sich auch während der Penetration in Schweinehaut. Hierbei stieg während der Penetration der TEMPO Anteil in der Membran an, während gleichzeitig die Polarität der Mikroumgebung von TEMPO deutlich abnahm. Des Weiteren wurden NLCs mit TEMPO beladen und die gleichen Untersuchungen wie mit den Invasomen durchgeführt. Es zeigte sich, dass die Verteilung von TEMPO in den Nanocarriern die Messzeit beeinflusst. Im Vergleich zu den Invasomen befand sich bei den NLCs weniger TEMPO in der lipidischen Phase der Nanocarrier. Dies führte im Vergleich zu den Invasomen zu einer verminderten Messzeit. Im Vergleich zur TEMPO-Lösung führten aber auch die NLCs zu einer verlängerten TEMPO-Detektion, was auf Stabilisierung und langsame Freisetzung von TEMPO hinweist. Diese Arbeit hat deutlich gezeigt, dass die EPR Spektroskopie mit der Verwendung von Spinsonden die Messung (a) der antioxidativen Kapazität in vivo und (b) von oxidativem Stress (induziert durch Strahlung oder andere Stressfaktoren) ermöglicht sowie die Untersuchung der (c) Penetrationsverstärkung und Stabilisierung von Spinsonden durch Nanotransporter erlaubt. Für (a) und (b) sind Messungen an einem L-Band EPR Spektrometer ausreichend, für (c) sind Messungen bei unterschiedlichen Frequenzen notwendig.