Analyse von kardialen Wnt/β-Catenin Interaktionspartnern bezüglich ihrer Möglichkeit, die embryonale Kardiogenese zu aktivieren

Abstract

Eine Herzinsuffizienz ist mit einer erheblichen Morbidität und Mortalität verbunden. Daher ist die Analyse von Signaltransduktionswegen, die im Herz- Remodeling involviert sind, essentiell zur Entwicklung neuer Therapieansätze. Eine wichtige Rolle bei der endogenen Regeneration spielen die kardialen Vorläuferzellen (cardiac progenitor cells; CPCs). Jedoch sind die molekularen Signalwege, durch die die CPCs positiv auf das kardiale Remodeling wirken, bisher ungeklärt. Die Regulierung der Aktivierung von CPCs durch den Wnt/β -Catenin-Signalweg stellt einen hochkonservierten und essentiellen embryonalen Entwicklungsmechanismus dar. In Vorarbeiten konnte gezeigt werden, dass die Inhibition der β-Catenin abhängigen Signaltransduktion eine positive Wirkung auf das linksventrikuläre Remodeling und die Differenzierung der CPC nach einem Herzinfarkt hat. Zur Identifikation von potenziellen kardialen Interaktionpartnern von β-Catenin wurde eine Hefe-Zwei-Hybrid Analyse mit β-Catenin als „Köder“ und einer kardialen cDNA-Bibliothek durchgeführt. Um den Einfluss von FHL2 auf die zellulären und molekularen Mechanismen bei der Kardiogenese und deren Regulation innerhalb des Wnt/β-Catenin-Signalweges zu untersuchen, wurden verschiedene in vitro Differenzierungsassays durchgeführt. Dabei konnte gezeigt werden, dass eine transiente FHL2-Überexpression die kardiale Differenzierung von P19 Zellen fördert. Dem gegenüber stehen die Ergebnisse des mESC in vitro Assays, bei dem die stabile FHL2-Überexpression die Bildung früher kardialer Zellen fördert, aber deren finale Differenzierung durch eine erhöhte β-Catenin Expression im Nucleus inhibiert wird. Dieser Zusammenhang konnte in einem pharmakologischen Rescue-Experiment durch Quercetin bestätigt werden. Dabei kommt es zur Inhibition der β-Catenin abhängigen Transkription, die zur Re-Aktivierung der finalen Differenzierung führt. Diese Beobachtungen zeigen, dass FHL2 durch die Aktivierung der β-Catenin abhängigen Transkription einen positiven Einfluss auf die Spezifikation mesodermal-kardialer Progenitorzellen hat. Darüber hinaus konnte durch eine Regulation des frühen kardialen Transkriptionsfaktors Tbx5 ein weiterer Zusammenhang zwischen FHL2 und der frühen Kardiogenese gezeigt werden. Diese Untersuchungen konnten nicht nur eine bisher unbekannte nukleäre Protein-Interaktion zeigen, sondern auch die Aktivierung des Tbx5-Promotors durch FHL2. Der Einfluss von Tbx5 auf die kardiale Homeostasis, sowie auf das linksventrikuläre Herz-Remodelings sollte ausserdem anhand eines Maus-Modells mit indudzierbarer kardialer Tbx5-Depletion untersucht werden. In einem Langzeitversuch unter kardialer Tbx5-Depletion konnte gezeigt werden, dass die Tbx5-Depletion unter Normalbedingungen im adulten Herzen keine Rolle spielt, es jedoch zu einer verringerten Population an differenzierungsfähigen kardialen Vorläuferzellen kommt. Es wird daher vermutet, dass Tbx5 nicht nur, wie bereits bekannt, die frühe kardiale Spezifikation fördert, sondern auch an der finalen Differenzierung beteiligt zu sein scheint. Die so gewonnenen Erkenntnisse sind essentiell für die Entwicklung neuer Strategien, um den Verlauf des adulten Herzremodelings, welches zur Herzinsuffizienz führt, verhindern zu können und die regenerative Fähigkeit des adulten Herzen zu aktivieren.

Heart failure is nowadays the cause of high morbidity and mortlity. Understanding the molecular mechanisms involved in the process of heart remodeling, might open new therapeutical approaches to avoid heart failure. Adult cardiac progenitor cells (CPCs) are known to play an important role in endogenous cardiac regeneration during cardiac remodeling. However, the extent to which these cells contribute to tissue homeostasis and/or repair as well as the signaling pathways controlling their differentiation remains unclear. Regulation of progenitor cell activation during early cardiogenesis through the Wnt/β-catenin pathway is a highly conserved mechanism, which may become lost in the adult heart. A previous work demonstrated that downregulation of β-catenin may be beneficial for tissue remodeling upon cardiac stress. Therefore, the identification of cardiac interaction partners, modulating the activation of β-catenin dependent gene transcription in the adult heart and their potential to regulate the cardiogenic transcriptional program, may help to elucidate possible candidates to positively influence cardiac remodeling. Performing a yeast two-hybrid screen with a human heart library, the present study identified and subsequently validated the specific interaction between FHL2 and β-catenin in cardiac cells. Induction of cardiac differentiation employing pluripotent P19 cells as an in vitro model of cardiomyogenesis showed that the transient overexpression of FHL2 result in an increased cardiac differentiation. Furthermore, a stable overexpression of FHL2 in mESCs results in an increased mesodermal and cardiac lineage, but in an inhibition of final cardiac differentiation. Mechanistically, FHL2 overexpression promoted high levels of nuclear β-catenin, which finally results in an increased β-catenin transcriptional activity. A rescue-experiment using the pharmacological inhibitor of β-catenin dependent transcription Quercetin, re- activated the inhibited cardiac differentiation in vitro. These data suggest that FHL2 promotes stem cells to acquire cardiac identity via modulating nuclear β-catenin expression as described in embryonic cardiogenesis. The ability of FHL2 to re-activate the cardiogenic program in the adult injured heart needs to be further investigated. Furthermore, the early cardiac transcription factor Tbx5 was found to be regulated by FHL2. A novel nuclear protein-protein-interaction between FHL2 and Tbx5 along with an activation of the Tbx5-promotor via FHL2 is described in the present study. These data suggest that Tbx5 participate in an increased activation of cardiac precursor cells upon FHL2 overexpression. The role of Tbx5 during adult cardiac homeostasis was investigated in an in vivo mouse model with inducible cardiac Tbx5-depletion. A long-term analysis of these mice shows no apparent functional defect demonstrated by echocardiography analysis. By meaning of FACS analysis a decreased population of more committed cardiac precursor cells was detected in contrast to an upregulation of early cardiac progenitor cell population. These data suggest, that Tbx5 is not essentiel during cardiac specification, but also for the final differentiation. FHL2 is specifically and abundantly expressed in the cardiovascular system, which makes it a promising target for cardiac-specific gene regulation upon cardiac diseases to finally activate CPC upon cardiac remodeling. The anticipated gain in knowledge may ultimately help to identify new drug targets to unlock the regenerative potential of the adult heart.